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研究背景：内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)是一种特殊的单个核细胞,其在趋化因子的作用下,能迁移至血管损伤及缺血部位,在血管的修复和再生中起重要作用。它们主要通过两种途径发挥生物学功能：分化为成熟内皮细胞和分泌细胞因子。在多种血管疾病中,EPC的数量和活性均有明显降低,因此它被认为是反映活体成血管能力和评估心血管疾病严重程度的潜在指标。内皮功能障碍在肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)的发生、发展中扮演关键角色,其本质是内皮受损与修复的失衡。越来越多的临床及动物实验数据证明体外扩增的EPC移植对内皮损伤性疾病有治疗效果,其中包括PAH。动物研究表明：EPC移植野百合碱诱导的肺血管内皮受损大鼠,移植组大鼠肺动脉收缩压无显著增高,而对照组则在3周后形成肺动脉高压。EPC移植治疗特发性肺动脉高压患者的临床研究结果显示移植组患者六分钟步行距离增加,肺血管阻力下降。然而,一些学者提出相反观点。EPC被证明能分泌促炎因子并参与滋养血管的生成。决定移植细胞疗效的关键因素是机体病理微环境。研究证实正常EPC对血管起保护作用,而长期处于疾病环境下的EPC会加重血管损伤。血清中不断增高的可溶性CD40配体(soluble CD40ligand, sCD40L)浓度是PAH疾病发展过程中的一个典型病理改变。CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族,在多种细胞膜表面均有表达,而sCD40L是其功能配体。它们的联接能通过调控多种免疫及非免疫细胞引发并扩大血管内膜的炎症反应。近年来,CD40通路在PAH疾病发展过程中扮演的角色逐渐受到重视,然而其对移植EPC的调控作用及其潜在机制尚待明确。本研究旨在明确CD40/CD40L通路对EPC各项功能的调控作用及其在PAH细胞移植疗法中的应用。研究方法：(1)由SD大鼠腿骨骨髓中以密度梯度离心法分离获取原代EPC。利用双染法及流式表面标记物鉴定EPC。培养第7天给予sCD40L (0,0.1,0.5,1,2μg/ml)浓度梯度刺激。(2)构建Lv-shRNA-CD40慢病毒载体,转染EPC18小时,构建shRNA-CD40EPC并验证其抑制效率。(3)离体实验中检测sCD40L对EPC增殖、迁移、粘附、成血管功能的调控作用。其中CCK-8试剂盒检测增殖功能,transwell迁移小室实验检测迁移功能、细胞贴壁法检测粘附功能、体外成血管试剂盒检测成血管功能。(4)验证sCD40L对EPC旁分泌功能的影响。sCD40L浓度梯度处理EPC,ELISA法检测EPC培养基中IL-6,sICAM,VEGF的改变。用EPC条件培养基培养内皮细胞,检测内皮细胞成血管功能的改变。(5)野百合碱皮下注射构建大鼠PAH模型,每周予右心导管检测其血流动力学改变,组织HE及EVG染色检测血管重构,ELISA法检测sCD40L浓度的改变。(6) shRNA-NC EPC及shRNA-CD40EPC分别在野百合碱注射后第7、14、21天尾静脉回输移植,同种细胞组内比较不同阶段回输的疗效,两种细胞组间比较同阶段回输的疗效。(7)肺组织冰冻切片CD31免疫荧光,共聚焦显微镜观察携带绿色荧光蛋白的移植EPC在血管内的定位情况及其内皮特性。计算EPC的管周替代率。研究结果：(1) sCD40L浓度梯度损伤EPC体外增殖、迁移、粘附、成血管功能。(2) sCD40L浓度梯度增加EPC分泌IL-6, sICAM,VEGF的功能。(3) sCD40L预处理逆转EPC条件培养基对内皮细胞的保护作用。(4)PAH各项检测指标于造模两周可见明显改变。各阶段PAH给予EPC移植均有疗效。常规EPC移植效果短暂,shRNA-CD40EPC疗效更显著且更持久。(5) shRNA-CD40EPC较多结合至血管内膜,较少在血管中膜及外膜。结论：sCD40L浓度梯度损伤EPC体外成血管相关功能,但增加其旁分泌功能。PAH模型中,CD40基因沉默的EPC比常规EPC移植能获得更明显且更持久的疗效。