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杜氏盐藻(Dunaliella salina以下简称盐藻)是已知最为耐盐的真核生物之一,但到目前为止,其耐盐的分子机制及应答盐胁迫信号的分子途径还不清楚。磷脂酶C(phospholipase C,简称PLC)能够水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2),产生两个重要的第二信使。磷脂酰肌醇信号通路广泛参与生物体内多种细胞信号转导过程,磷脂酶C是该信号途径中的关键酶,因此,深入探讨盐藻磷脂酶C的生物学特性及作用机制,对于阐明盐藻应答盐胁迫信号的分子途径具有重要科学意义。本研究的实验方法及结果如下:1.利用RT-PCR技术扩增了DsPLC的开放阅读框序列,构建了原核表达载体pGS21a-DsPLC,将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白,通过SDS-PAGE检测,在上清和包涵体中都有融合蛋白的存在。可溶性蛋白经过GST纯化柱纯化,结果表明,在96 KD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在96 KD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的磷脂酶C蛋白。2.将盐藻DsPLC开放阅读框序列连接到带有绿色荧光蛋白基因的亚细胞定位表达载体pMDCG上,成功构建了亚细胞定位表达载体pMDCG-DsPLC,通过冻融法将其转入农杆菌,利用农杆菌介导法将表达载体导入洋葱表皮细胞,使DsPLC在洋葱表皮细胞中成功表达,明确了盐藻磷脂酶C主要分布在细胞内膜系统中。3.将杜氏盐藻DsPLC基因的开放阅读框与酵母双杂交诱饵表达载体pGBKT7-BD连接,构建了诱饵表达载体p GBKT7-DsPLC,利用热激法将其导入酵母菌Y2H Gold中。将含有诱饵表达载体的酵母菌Y2H Gold与含有杜氏盐藻cDNA文库的酵母菌Y187进行杂交实验,从文库中筛选出与诱饵蛋白相互作用的蛋白质,通过生物信息学方法分析该蛋白的生物学功能。