【摘 要】
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目的:快速生长的肿瘤细胞优先通过有氧糖酵解利用葡萄糖,这种独特的代谢方式称为“沃伯格效应”。越来越多的证据表明,微小RNA（miRNA）可以调控这种代谢重编程。本研究旨在从肿瘤微环境的角度探索miR-885-5p在肝癌发生发展中的作用;探讨miR-885-5p在缺氧的肝癌微环境中是否调控“沃伯格效应”及潜在靶点;进一步通过生物信息学分析miR-885-5p及其靶基因的功能和预后价值。方法:应用Ag
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目的:快速生长的肿瘤细胞优先通过有氧糖酵解利用葡萄糖,这种独特的代谢方式称为“沃伯格效应”。越来越多的证据表明,微小RNA（miRNA）可以调控这种代谢重编程。本研究旨在从肿瘤微环境的角度探索miR-885-5p在肝癌发生发展中的作用;探讨miR-885-5p在缺氧的肝癌微环境中是否调控“沃伯格效应”及潜在靶点;进一步通过生物信息学分析miR-885-5p及其靶基因的功能和预后价值。方法:应用Agilent human miRNA array分析得到miR-885-5p在7株肝癌细胞株和3例原代正常肝细胞中的表达情况,进一步通过qRT-PCR在上述细胞株和50对肝细胞癌和配对癌旁组织进行验证;构建不同类型的缺氧模型,选择合适的缺氧方式和作用条件进行后续细胞水平实验;构建阳离子脂质体转染miR-885-5p并对其转染效率进行评价;对肝癌细胞进行缺氧诱导并转染miR-885-5p mimic或inhibitor及对应的对照,通过细胞增殖,侵袭,迁移实验,细胞凋亡和周期分析探讨miR-885-5p在肝细胞癌发生发展中的作用;通过裸鼠成瘤实验进一步验证在细胞水平的发现;在缺氧诱导的肝癌细胞中通过糖酵解表型实验（葡萄糖摄取和乳酸产生等）明确miR-885-5p是否在缺氧的肝癌细胞中调控糖酵解。Western Blot检测在缺氧诱导的肝癌细胞中过表达miR-885-5p后糖酵解关键酶在蛋白水平的表达;利用Target Scan等在线数据库预测miR-885-5p的潜在靶点,通过qRT-PCR、Western Blot和Luciferase精确靶点实验进一步验证;在过表达miR-885-5p的肝细胞癌中用si RNA干扰技术下调缺氧诱导因子HIF-1α,通过Western Blot检测靶基因HK2和其他糖代谢关键酶的表达以明确miR-885-5p调控糖酵解的分子机制。通过Western Blot和免疫组织化学方法分别检测靶基因HK2在HCC细胞和组织水平的表达;运用多种数据库采集肝细胞癌患者的临床数据进行miR和其靶基因表达量的生物信息学分析,探索表达与患者的临床特征的相关性,对基因表达进行蛋白互作、GO和GSEA功能富集分析,并评价miR-885-5p及其靶基因的预后价值。结果:结合微阵列分析的结果,qRT-PCR结果显示,miR-885-5p的表达在HCC肿瘤组织和细胞系相对于配对癌旁正常组织和正常原代肝细胞中均显著下调;miR-885-5p在不同缺氧模型（缺氧培养箱,缺氧化学诱导剂Co Cl2和DFX去铁胺）中表达均较常氧状态普遍下调;脂质体具有较高的转运效率,可以被HCC细胞快速摄取并完整释放miR-885-5p;外源性过表达miR-885-5p可抑制HCC细胞的增殖,迁移能力并在体外诱导了细胞发生凋亡,相对于常氧,缺氧诱导的细胞模型中对HCC细胞上述表型的抑制更显著;治疗性应用miR-885-5p可明显抑制裸鼠皮下瘤的生长;缺氧诱导的HCC细胞中miR-885-5p可以抑制葡萄糖的摄取和乳酸的产生从而调控糖酵解。HCC中miR-885-5p在缺氧环境下调节糖酵解是通过抑制HIF-1α,GLUT1,HK2,LDHA实现的,HK2被发现是miR-885-5p的直接靶基因;HIF-1ɑ参与了缺氧环境下miR-885-5p对HK2的调控。Western Blot和免疫组织化学分析表明HK2在HCC细胞系和组织中表达均明显高于正常肝细胞和正常组织;HK2的互作蛋白均为糖酵解途径的关键蛋白,其高表达组的基因集富集在细胞因子产生,蛋白分泌,对生物刺激的反应,GTP酶活动,MAPK通路调控,免疫防御调控,运动,细胞粘附等方面;miR-885和HK2对HCC患者均具有预后价值。结论:我们发现了缺氧调控的miR-885-5p可以在HCC中调控糖酵解过程,进而在HCC的发生和进展中具有重要作用,此调控部分是通过HIF-1ɑ介导靶向HK2实现的。miR-885-5p和HK2均与HCC患者临床预后密切相关,全面且综合分析miR-885-5p/HK2调控轴或许能帮助我们探寻HCC患者的新的治疗靶点和精准评价患者预后。
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