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研究目的急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF)是一类病情迅速进展的临床症候群,患者病情较重,病死率极高,缺乏特异性治疗方法。肝移植是ALF目前最有效的治疗方法,但因为禁忌症较多且供肝较少,限制了其使用。寻找有效的治疗方法对ALF患者具有重要意义。糖皮质激素(Glucocorticoids,GCs)可快速抑制过度免疫反应和炎症反应。前期临床研究表明,GCs治疗ALF可有一定临床获益,但由于其具体作用机制不明确,合适治疗人群较难确定,治疗指征较难把握,使其使用存在较多争议。本研究旨在明确地塞米松(Dexamethasone,Dex)对脂多糖/D-半乳糖胺(Lipopolysaccharide/D-galactosamine,LPS/D-Ga IN)诱导的ALF小鼠的治疗效果,并深入探讨其发挥作用的具体免疫学机制。研究方法1.给予C57BL/6小鼠LPS/D-Ga IN腹腔注射建立小鼠ALF模型。取造模后1-5h小鼠肝脏行H&E染色并检测血清肝酶ALT和AST,明确ALF小鼠疾病进展中肝损情况;CBA法检测造模不同时间点血清细胞因子IL-6、TNF-α、CCL-2和IL-10的变化;取小鼠肝脏和血液行多色流式,明确造模不同时间点肝脏和血液B、CD4、CD8、NK、NKT、Kupffer细胞、单核细胞和中性粒细胞等免疫细胞亚群的变化。2.LPS/D-Ga IN诱导的ALF小鼠在造模0h和1h腹腔注射Dex观察其治疗效果。绘制生存曲线分析造模不同时间点给予Dex对ALF小鼠生存率的影响;H&E染色和血清肝酶检测明确Dex对ALF肝损伤进展的影响;CBA法检测细胞因子变化;多色流式明确肝脏和血液免疫细胞亚群变化情况。3.流式分选LPS/D-Ga IN造模组和Dex 0h治疗组小鼠肝脏Kupffer细胞。免疫组化染色F480确认流式检测结果;q PCR检测分选出的Kupffer细胞CD86和CD163 m RNA水平;RNA测序进一步明确两组间Kupffer细胞差异。4.使用肝脏巨噬细胞清除剂氯膦酸二钠脂质体(CL)清除肝脏巨噬细胞。流式细胞术和免疫组化明确其清除效果;ALF小鼠早期使用Dex或CL,H&E染色和血清肝酶检测明确巨噬细胞在造模早期使用Dex治疗ALF中的作用。5.ALF小鼠早期使用Dex或GR受体抑制剂RU486,观察其对小鼠生存率的影响,H&E染色和血清肝酶检测明确肝损情况。q PCR检测RU486作用后Kupffer细胞NR4A1 m RNA水平;研究结果1.LPS/D-Ga IN可成功诱导小鼠ALF,5h即可出现明显肝衰竭表现。该模型早期即存在细胞因子风暴,肝脏和血液固有免疫细胞如Kupffer细胞、中性粒细胞和单核细胞在疾病进展中数目变化较明显。2.相较造模1h组,造模0h使用Dex可显著改善LPS/D-Ga IN诱导的小鼠ALF疾病进展,同时可显著降低IL-6、TNF-α和CCL-2等促炎细胞因子,升高抑炎因子IL-10。固有免疫细胞尤其是Kupffer细胞和中性粒细胞在Dex 0h治疗组显著上升。3.相较模型组,Dex 0h治疗组小鼠肝脏Kupffer细胞数目显著增加,且以M2型为主。RNA测序表明,Dex治疗组Kupffer细胞中NR4A1的m RNA水平显著增加。4.CL提前作用24h可有效清除肝脏巨噬细胞。但早期清除肝脏巨噬细胞,再予以小鼠腹腔注射LPS/D-Ga IN,并未出现明显肝衰竭表现。ALF小鼠造模前清除肝脏巨噬细胞,再早期加用Dex,对Dex治疗ALF的作用无明显影响。5.使用RU486后,LPS/D-Ga IN造模早期使用Dex改善ALF小鼠生存率和缓解肝损伤的作用被抑制。GR抑制后,早期使用Dex增加肝脏Kupffer细胞中NR4A1 m RNA的作用也被抑制。研究结论1.LPS/D-Ga IN可成功诱导小鼠ALF模型。2.ALF造模早期使用Dex可改善疾病进展。3.ALF造模早期使用Dex可显著增加肝脏Kupffer细胞,主要以M2型为主,且Kupffer细胞中NR4A1的m RNA水平显著增加。4.造模前期直接清除肝脏巨噬细胞,并不能解释Kupffer在早期使用Dex治疗ALF中的重要作用。5.早期使用Dex改善LPS/D-Ga IN诱导的小鼠ALF,主要通过GR基因组机制发挥作用。6.早期使用Dex增加肝脏Kupffer细胞中NR4A1 m RNA的作用需要GR参与。