背景胰腺癌是一种极度恶性的消化系统肿瘤,现已成为第三大常见的癌症死因,其发病率呈逐年上升趋势,而死亡率保持相对稳定,预计至2030年将跃升为第二大常见癌症死因,造成全球巨大的健康和经济负担。该病的特点是症状出现较晚,治疗手段非常有限,5年生存率低于9%,因此被称为“癌中之王”。目前,根治性手术仍是治愈胰腺癌的唯一希望,然而多数患者确诊即处晚期阶段,已失去治愈机会,尽早发现是提高其生存率和生活质量的最佳办法。胰腺癌病因、诊断、治疗等方面的研究进展相对滞后于其他肿瘤,目前病因尚不完全清楚,推测应为遗传和环境共同作用的结果;诊断主要依赖胰腺成像,缺乏有效的早诊工具;对放化疗及免疫治疗均不敏感,手术适用人群很有限。据估计,胰腺癌的发展时长超过十年,因此确实存在进行及早干预的机会之窗。共生菌群作为重要的环境因素,已被证实在多种癌症发病过程中扮演重要角色,其间的互作比预期得要大。学界对胰腺癌患者普遍存在菌群失调的现象是确定的,但对其紊乱的具体特征尚未达成一致结论。已发表的各胰腺癌菌群研究在研究手段、实验设计和人群选择上多有差异,这些都可能影响菌群特征分析结果,从而得到不同甚至矛盾的结论。参考当前研究的局限性,为更好地了解中国胰腺癌患者的菌群特征,本研究以一个较大临床队列的口腔菌群和肠道菌群为研究对象,对胰腺癌菌群特征进行全面描述,分析了开发菌群生物学标志物作为胰腺癌无创诊断工具的潜力,初步探讨了菌群可能参与胰腺癌进程的致病机制,为胰腺癌的诊疗提供新的思路。目的分析中国胰腺癌人群的口腔及肠道菌群特征,评价微生物标志物作为胰腺癌无创诊断工具的潜力,初步探讨菌群在胰腺癌发病过程中的作用和相关机制。方法1.纳入长海医院胰腺外科收治的50名胰腺癌(Pancreatic cancer,PC)患者、东部战区空军医院健康管理中心体检的50名健康志愿者(Health control,HC)、长海医院消化内科收治的15名慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)患者,采集他们的同期唾液和粪便样本,并迅速分装冻存备用。同时详细记录其基本人口学资料,内容包括:年龄、性别、BMI、种族、饮食习惯、基础疾病史、药物服用史、消化系统手术史。2.根据课题组前期研究成果,结合文献调研,选取18个可能与胰腺癌相关的临床检验指标:UA、CA19-9、CEA、CA125、RBC、WBC、LYMP%、NEU%、EOS.abs、HGB、HCT、P-LCR、TBiL、DBiL、GLU、Amy、FIB 和 CRP。对入组胰腺癌患者样本采集同期的这些检验指标结果进行收录。3.对所有样本进行同批次的总DNA提取,针对16S rRNA基因V3-V4区域进行PCR扩增,构建文库并质检、定量、混样,利用Illumina MiSeq PE250高通量测序平台进行测序,原始测序数据进行拼接质控,获得操作分类单元(OTU),对唾液OTU和粪便OTU平行进行一系列分析:包括OTU聚类、抽平处理、Core microbiome分析、Venn图分析、OTU的PCA分析、物种累积曲线分析。获得OTU丰度表,再进行物种分类和丰度分析、α多样性分析、β多样性分析。4.对唾液样本和粪便样本的物种分类数据平行分析。各组进行物种的LEfSe差异分析、秩和检验分析等显著性差异分析;在此基础上利用随机森林算法构建诊断模型;对传统肿瘤标志物对胰腺癌的诊断效能进行评估;对鉴定到的胰腺癌差异菌属进行Spearman相关系数分析;对胰腺癌差异菌属与临床检验指标进行Spearman关联分析;对差异菌群进行16S功能预测分析。结果1.经临床确诊和测序质控后,最终纳入88例唾液样本(37 PC,36 HC,15 CP)和92例粪便样本(38 PC,39 HC,15 CP)的16S rRNA测序数据用于后续分析。2.胰腺癌组的口腔菌群α多样性高于慢性胰腺炎组,但与健康对照组无显著差异。胰腺癌的菌群结构发生了显著变化,具体来说:与其他2组相比,胰腺癌患者组中共有厚壁菌门Firmicutes和疣微菌门Verrucomicrobia两个菌门的平均相对丰度显著升高;共有韦荣球菌属Veillonella、消化链球菌属Peptostreptococcus、阿克曼菌属Akkermansia、微单胞菌属Parvimonas、Solobacterium、欧氏菌属Olsenella、大肠杆菌属-志贺氏菌属Escherichia_Shigella等7个菌属的平均相对丰度显著升高。与健康对照组相比,胰腺疾病组中共有一个菌门(厚壁菌门Firmicutes)的平均相对丰度显著升高;共有拟普雷沃菌属Alloprevotella、颗粒链菌属Granulicatella、Solobacterium、链球菌属Streptococcus等4个菌属的平均相对丰度显著升高。差异口腔菌属多表现为明显协同共生关系,仅韦荣球菌属Veillonella、口腔杆菌属Stomatobaculum和优杆菌属Eubacterium等几个菌属与其他多个差异菌属为竞争关系。3.胰腺癌人群的口腔菌群特征主要表现在以颗粒链菌属Granulicatella、Solobacterium、拟普雷沃菌属Alloprevotella和消化链球菌属Peptostreptococcus为代表的口腔致病菌发生显著富集。16S功能预测胰腺癌口腔菌群对代谢的影响不大,主要强化了促炎通路和免疫抑制通路,具体为细菌毒素、金黄色葡萄球菌感染与丙氨酸代谢等通路增强,NLR信号通路、抗原加工递呈与细胞迁移分泌等通路减弱。4.胰腺癌组的肠道菌群α多样性未明显改变,但菌群结构发生了显著变化,具体来说:与其他2组相比,胰腺癌患者组中只有一个菌门(变形菌门Proteobacteria)的平均相对丰度显著升高,普雷沃菌属Prevotella和Coprobacter等2个菌属的平均相对丰度显著升高;与健康对照组相比,胰腺疾病组中也只有变形菌门丰度显著升高,共有普雷沃菌属Prevotella、消化链球菌属Peptostreptococcus、放线菌属Actinomyces、气单胞菌属Aeromonas、双歧杆菌属Bifidobacterium、弯曲菌属Campylobacter、粪芽孢菌属Coprobacillus、大肠杆菌属-志贺氏菌属Escherichia_Shigella、戈登杆菌属Gordonibacter等9个菌属的平均相对丰度显著升高。差异肠道菌属间的竞争协同现象不十分明显,丁酸菌属Butyricicoccus、梭菌属Ⅳ簇Clostrdum Ⅳ、Fusicatenibacterium、粪杆菌属Faecalibacterium和吉米菌属Gemmiger这5个菌属表现出核心协同共生关系。5.胰腺癌人群的肠道菌群特征主要表现在益生菌丰度显著降低,而普雷沃菌属Prevotella、双歧杆菌属Bifidobacterium、大肠杆菌属-志贺氏菌属Escherichia_Shigella、消化链球菌属Peptostreptococcus和放线菌属Actinomyces为代表的条件致病菌丰度显著升高。差异菌属16S功能预测主要发现明显的炎症通路激活和脂肪酸代谢紊乱,具体为花生四烯酸代谢、α-亚麻酸代谢、脂肪酸延长、细胞色素P450代谢、脂多糖生物合成、致病性大肠杆菌感染和系统性红斑狼疮通路等增强,细胞骨架蛋白通路减弱。6.基于口腔/肠道菌群特征建立的胰腺癌诊断模型AUC值分别为0.916(95%CI:0.832-1)和0.856(95%CI:0.74-0.972),均对我们队列中的胰腺癌样本有良好的分类能力;此外还在队列中评估了传统肿瘤标志物对PC人群的分类能力,CA19-9联合CEA对PC的诊断效果最好,AUC值可达0.878(95%CI:0.805-0.952),提示微生物标记物具有发展为胰腺癌无创诊断工具的潜力。结合差异菌群、差异功能分析,筛选到可能参与胰腺癌病程的候选菌属:颗粒链菌属Granulicatella、消化链球菌属 Peptostreptococcus、普雷沃菌属Prevotella、双歧杆菌属Bifidobacterium、放线菌属Actinomyces和大肠杆菌属-志贺氏菌属Escherichia Shigella;分析了胰腺癌发生发展中可能关联的通路:细菌毒素、丙氨酸代谢、花生四烯酸代谢、脂多糖生物合成、系统性红斑狼疮通路、细胞骨架合成。结论本研究全面描述了一个中国胰腺癌队列的菌群特征,发现其菌群的多样性没有明显降低,但结构发生了明显改变。胰腺癌患者口腔中颗粒链菌属Granulicatella、消化链球菌属Peptostreptococcus、拟普雷沃菌属Alloprevotella、韦荣球菌属Veillonella、Solobacterium和链球菌属Streptococcus等口腔致病菌普遍富集;肠道中的益生菌丰度显著降低,以普雷沃菌属Prevotella、双歧杆菌属Bifidobacterium、大肠杆菌属-志贺氏菌属Escherichia_Shigella、消化链球菌属Peptostreptococcus和放线菌属Actinomyces为代表的条件致病菌丰度显著升高。基于口腔或肠道菌群特征的诊断模型均能良好地区分我们队列中的胰腺癌样本,说明微生物标志物具有发展为胰腺癌无创诊断工具的潜力。并且,由于唾液样本临床易采集、患者依从性好、实验易操作等优点,未来可能是更优的胰腺癌无创微生物检测样本类型。此外还鉴定到了可能参与胰腺癌病程的候选菌属和相关通路。我们的研究结果有助于进一步认识菌群在胰腺癌中的作用,为其诊疗提供新的思路。需注意的是,我们在一个中国胰腺癌临床队列中证实了菌群与胰腺癌的相关性,但本研究并未就二者间是否存在因果联系取得直接证据。基于我们的研究分析,结合已知的胰腺癌研究结果,我们提出了一种观点,即PC高风险因素(如吸烟、酗酒等)与口腔菌群互作,导致口腔菌群失调,在组织屏障受损的前提下,口腔中的有害细菌发生移位并定植于胰腺,逃避免疫监视,通过直接的局部作用,引起组织炎症,导致微环境氧化应激失衡,改变能量动力学,破坏DNA,最终导致分子改变和肿瘤转化,驱动肿瘤进程。而PC高风险因素(如吸烟、饮酒、不健康饮食)等也可与肠道菌群互作,菌群失调从而改变代谢通路、激活促炎通路,破坏肠道屏障,代谢物经肠系膜静脉途径、有害细菌经肠系膜淋巴途径进入胰腺,促进抑制性免疫细胞分化,从而影响肿瘤微环境,通过远程和局部两种途径促进肿瘤的发生。