微波超声表面活性剂辅助法联合真菌梯级提取杜仲叶中总黄酮与杜仲胶的工艺研究

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杜仲(Eucommia ulmoides Olive.)属于多年生落叶乔木被划分为杜仲科杜仲属,又名扯丝皮、丝联木,是我国特有的经济树种,同时也是国家珍贵的二类保护物种。现代科学研究表明,杜仲叶中含有大量的黄酮成分,还富含白色丝状杜仲胶(Eucommia ulmoides gum,EUG)。黄酮类化合物传统提取溶剂为乙醇或丙酮与水,其存在环境污染的潜在风险,以水为提取溶剂虽然绿色但提取率较低。目前,杜仲胶的提取常以正己烷或石油醚作为主要溶剂,存在有机溶剂消耗量大、成本高、污染环境、安全隐患等问题。并且,还没有出现黄酮和杜仲胶的同时绿色提取的工艺报道,急需进行工艺升级。
  基于上述原因,本文首先选用对杜仲叶黄酮具有较好增溶性的阴离子表面活性剂为提取溶剂,采用微波超声强化提取叶黄酮,同时表现出对杜仲叶表面角质层较强的去除效果,以利于微生物的培养;在此基础上,以绿色木霉为菌种,对提取总黄酮后的杜仲叶残渣进行发酵培养,代谢其中综纤维素以破坏杜仲叶结构,提高杜仲胶含量与提取溶剂的接触面积,达到提高杜仲胶提取效率和节约溶剂的目的。总结来说,就是首先利用微波超声辅助表面活性剂法提取杜仲叶中的黄酮类化合物,然后利用真菌与溶剂联合作用提取杜仲叶残渣中的杜仲胶,达到一个工艺流程提取总黄酮与杜仲胶的目的,达到一个分步梯级的效果。主要研究内容与结果如下:
  1、以表面活性剂十二烷基苯磺酸钠胶束为提取介质,采用微波超声辅助法提取杜仲叶中总黄酮及去除杜仲叶表面角质层。以响应面优化杜确定仲叶黄酮的最佳提取工艺为:表面活性剂十二烷基苯磺酸钠浓度为1.5%,提取时间为30min,提取次数2次,料液比为1∶50和微波功率为700W。在此条件下杜仲叶黄酮的得率为1.45%,提取率达到73.97%,比在相同条件下纯水得率0.36%,提高约为4倍。同时,提取前后杜仲叶表面角质层苏丹Ⅲ染色表明,提取后杜仲叶表面角质层基本去除,有利于后续绿色木霉的发酵培养。
  2、以提取黄酮和去除表面角质层后杜仲叶残渣为原料,采用绿色木霉液体发酵法代谢其中综纤维素,以提高杜仲胶含量。以正交实验法优化确定绿色木霉最佳发酵条件为:杜仲叶残渣混悬液pH为6,杜仲叶固相物含量9.9%(即固液比1∶10),绿色木霉接种量为20%(以悬浮液体积计算,菌种浓度约为5×106CFU/mL),发酵时间为5d,绿色木霉的酶活性为19.88U/mL。在此条件下,杜仲叶残渣失重率为43.81%,杜仲胶的含量由1.7%上升到4.36%。同时,杜仲叶残渣中的纤维素和半纤维素含量分别从原来的25.93%和19.33%,减少为14.81%和8.35%,而木质素含量几乎无变化,这说明绿色木霉主要降解底物为综纤维素。又通过直观观察与SEM扫描电镜再结合综纤维素的前后变化,综合分析可以得出,绿色木霉能有效的破坏杜仲叶的叶片结构。
  3、以绿色木霉发酵去除综纤维素后的杜仲叶为原料,采用石油醚为溶剂进行杜仲胶提取,与杜仲原叶相比单位质量杜仲胶溶剂消耗量由2.74mL/g下降为0.70mL/g,溶剂节省率为74.5%。又以绿色溶剂松节油进行杜仲胶提取,单位质量杜仲胶溶剂消耗量由2.91mL/g下降为0.96mL/g,溶剂节省率为67.01%。在此基础上,采用石油醚洗涤杜仲胶,最终纯度为96.6%杜仲胶。通过红外光谱分析核磁共振氢谱分析结果表明,绿色木霉发酵后以松节油提取的杜仲胶结构与传统的一致。
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