肝癌(主要是肝细胞癌,hepatocellular carcinoma,HCC)的预后较差。目前,手术切除仍为肝癌最有效的治疗方法。但即使根治性切除,5年内仍有60％～70％的转移复发率。转移复发已成为进一步延长肝癌病人生存期、提高远期疗效的瓶颈问题,也是最终攻克肝癌的关键所在。　　越来越多的证据表明肿瘤干细胞由于具有自我更新、产生和维持肿瘤生长和导致细胞异质性的原始细胞及分化细胞的能力,是肿瘤发生和复发的根源。肿瘤干细胞和其它成体干细胞高度相似,学者推测干细胞在体内通过长期的积累突变而获得不确定的增殖能力进而转化为肿瘤干细胞。因此在分子调控水平研究干细胞向肝癌干细胞发展的分子机制,有利于探索早期诊断和彻底治疗肝癌的新方法。　　研究发现Oct4、Sox2和Nanog在早期胚胎干细胞发育分化调节中发挥重要作用,其通过调节胚胎干细胞的基因转录,从而维持其多潜能性和自我更新的能力。　　本课题首先研究此三个干细胞相关因子在HCC中的表达水平变化,并在此基础上进一步研究Oct4的表达对肝癌以及肝癌干细胞的细胞生物学行为的影响及其可能机制。　　第一部分：肝细胞癌中干细胞相关因子Oct4,Sox2和Nanog的表达水平及其与肿瘤复发和预后的关系　　一、免疫组织化学检测肝细胞癌组织中干细胞相关转录因子Oct4,Sox2和Nanog的表达水平及其与预后的关系。　　[目的]检测HCC组织中干细胞相关转录因子Oct4,Sox2和Nanog的表达情况,评价相关因子对肝癌术后复发及生存的影响。　　[方法]用免疫组织化学染色法对126例肝癌组织进行分析。研究Oct4,Sox2和Nanog在肝癌中的表达情况和并结合患者的病理资料分析了其表达水平与肝癌患者术后复发和生存的相关性。　　[结果]在HCC肿瘤组织中检测到了Oct4和Sox2的表达,但是没有检测到Nanog的表达。　　Oct4在HCC中主要分布在癌巢内,80例病人染色阳性(63.5％),9例病人癌旁染色阳性(7.1％);在癌巢内,Oct4特异性着色在细胞核内,染色明显;统计分析发现Oct4的表达与肝癌术后生存及复发无明显相关性。Oct4的表达与患者的年龄,性别,甲胎蛋白,肝硬化,肿瘤大小,包膜有无,血管侵犯和肿瘤分化情况均为明显相关性。　　Sox2在HCC的分布有两种情况:一种情况是特异性表达在细胞膜上,在阳性染色区域,可见细胞轮廓呈现明显的深棕色,胞浆胞核和细胞间质无明显着色;另一种情况就是特异性的表达在胞浆,呈颗粒状聚集、簇状分布在胞核附近。癌旁组织内有Sox2均匀的非特异性着色;癌组织内Sox2在细胞膜上的表达与肝癌术后生存和复发没有明显的相关性;Sox2在癌巢胞浆的表达与总生存没有明显相关性(p=0.871),与至复发时间明显相关(p=0.012),癌组织胞浆内Sox2阴性患者的至复发时间明显比Sox2阳性的患者要长。Sox2的表达情况与患者的年龄,性别,甲胎蛋白,肝硬化等临床病理学特征没有明显相关性。　　[结论]HCC组织中Oct4和Sox2的表达水平明显上调,且与HCC预后有关。　　二、Taqman探针法验证Oct4和Sox2在HCC病人中的mRNA水平表达。　　[目的]鉴于肝癌组织结构和病理特征的复杂性,利用免疫组化方法明确的判定肝脏癌组织和癌旁组织有一定的难度,所以,我们利用特异性Taqman探针引物实时定量PCR,检测HCC中Oct4和Sox2的mRNA表达水平。检测Oct4和sox2在HCC配对的癌和癌旁中的的表达水平差异,探讨Oct4和Sox2与HCC的关系。　　[方法](1)提取HCC组织的总RNA,进行逆转录。(2)使用特异性Taqman探针引物实时定量PCR,检测HCC中Oct4和Sox2的InRNA表达水平。　　[结果]与免疫组化的结果一致,Oct4主要在癌组织中表达(p=0.0157);验证了Sox2免疫组化结果中癌旁的均匀着色为非特异性的背景染色,Sox2主要在癌组织中表达(p=0.022)　　[结论]Oct4和Sox2在HCC癌组织中的mRNA表达水平明显高于癌旁组织。　　三、不同转移潜能的肝癌细胞系中Oct4和Sox2的表达水平　　[目的]研究Oct4和Sox2在不同转移潜能肝癌细胞系的表达水平,进一步验证其在肝癌发展过程中发挥的作用。　　[方法](1)选取并培养不同转移潜能的肝癌细胞系Bel-7402,SMMC-7721,PLC/PRF、HepG2,MHCC97L、MHCC97H和HCCLM3。(2)提取各细胞系的总RNA,通过反转录获得cDNA,并应用TaqMan(R)MGB探针法对其进行定量检测。(3)提取各细胞系的总蛋白,利用Western Blot检测目的蛋白的表达。(4)利用细胞免疫荧光对Oct4和Sox2进行定位检测。　　[结果](1)mRNA和蛋白质水平上的检测都发现Oct4在PLC/PRF、HepG2,MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3这五种细胞系中都有表达,而且表达水平是随着其侵袭转移能力增加而逐渐增强,差异显著(P＜0.001)(2)mRNA和蛋白质水平上的检测发现Sox2在HCC细胞中的表达都很低,但是在具有转移潜能的细胞MHCC97-L和MHCC97-H的表达明显高于无转移潜能的Bel-7402,SMMC-7721,PLC/PRF和HepG2(P＜0.001)。(3)细胞免疫荧光检测发现Oct4主要定位在细胞核,和之前的免疫组化结果一致:Sox2在细胞的胞膜,胞浆和胞核都有表达。　　[结论]利用肝癌细胞系进一步证实Oct4和Sox2可能在肝癌发生发展过程中发挥作用。并根据Oct4的表达情况,选取PLC/PRF,HepG2和HCCLM3进行下一步Oct4功能和机制研究。　　第二部分：Oct4对肝癌细胞生物学行为的影响及机制研究　　一、载体构建、载体转染/侵染和稳定细胞株的筛选　　[目的]构建Oct4过表达载体,筛选表达Oct4的稳定转染细胞株;包装5个Oct4的慢病毒shRNA干扰载体PLK0.1,挑选干扰效果最好的shRNA干扰载体,挑单克隆,筛选稳定细胞株。　　[方法]根据第一部分对HCC细胞系中Oct4蛋白表达情况的检测结果,我们选取了Oct4基础表达水平低的HepG2细胞和PLC/PRF,通过转染Oct4表达质粒,获得Oct4过表达细胞;选择Oct4基础表达水平高的HCCLM3,通过基因沉默阻断其表达,通过正反两个方面研究其对细胞生物学行为的影响。(1)构建Oct4过表达载体,并将其和对照空质粒分别转染Oct4低表达肝癌细胞株PLC/PRF和HepG2,利用Hygromyein筛选获得稳定转染细胞株。(2)包装5个Oct4的shRNA干扰载体PLK0.1和scramble的对照,侵染LM3后,挑选出干扰效果最好的shRNA。(3)将干扰效果最好的shRNA慢病毒侵染LM3和HepG2,利用Puromyein来挑单克隆,筛选稳定细胞株。　　[结果]经测序证实构建的Oct4过表达载体的序列正确,读码框无误;RealTimePCR和Westernblot检测过表达稳定细胞株Oct4的表达上调了5倍;同时检测5种shRNA慢病毒载体的干扰效率,并选取干扰效果最好的a5shRNA进行单克隆稳定细胞株的筛选,筛选出细胞克隆a5-2的基因沉默效果最好,发现稳定细胞株a5-2的Oct4下调65％。所以选取a5-2作为研究Oct4机制功能检测的基因沉默细胞株。　　[结论]成功构建并筛选出Oct4过表达的稳定细胞株和空载对照细胞株,以及Oct4基因沉默细胞株和对应的scramble对照细胞株。　　二、Oct4对肝癌细胞生物学行为的影响　　[目的]通过体外实验观察Oct4过表达和基因沉默对HCC细胞凋亡、细胞增殖、运动、侵袭、粘附以及细胞转化和抗化疗能力的影响;通过体内实验通过裸鼠人肝癌模型进一步验证Oct4过表达对于HepG2成瘤能力的影响。　　[方法]根据第一部分对HCC细胞系中Oct4蛋白表达情况的检测结果,我们选取了Oct4基础表达水平低的HepG2细胞和PLC/PRF,通过转染Oct4表达质粒,获得Oct4过表达细胞;选择Oct4基础表达水平高的HCCLM3,通过基因沉默阻断其表达,通过正反两个方面研究其对细胞生物学行为的影响。采用ANNEXINV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、CyQUANT细胞增殖试剂盒、Matrigel胶和软琼脂克隆形成实验分别比较Oct4过表达和基因沉默后肝癌细胞的细胞凋亡,细胞增殖、粘附、运动、侵袭能力及细胞转化能力的变化;将Oct4过表达和空载对照的HepG2细胞稳定细胞株(1×107/只)分别进行裸鼠皮下接种,每周两次观察并记录裸鼠的成瘤情况;裸鼠皮下接种四周后,处死裸鼠进行拍照;利用细胞增殖检测Oct4对HCC化疗药物敏感性的影响。　　[结果]流式细胞仪检测发现,与对照相比,Oct4过表达和基因沉默的细胞其凋亡情况都没有明显的差异(P=0.24);Oct4过表达的HepG2细胞增殖能力明显高于对照组(P＜0.001);而Oct4基因沉默的HCCLM3细胞,其增殖能力则明显低于对照组(P＜0.001);Oct4过表达的HepG2细胞与对照组相比,细胞的运动能力和粘附能力无显著差异。细胞侵袭实验检测发现Oct4过表达的细胞株穿过过人工基底膜的细胞数(150.2±10.1)明显多于对照质粒组的HepG2穿膜的细胞数(62.3+8.4):Oct4过表达的HepG2细胞在软琼脂胶中形成的克隆数明显高于对照组(P＜0.05);在5-Fu作用下,Oct4过表达的稳定细胞株的增殖能力明显高于对照细胞,接近于无5-Fu无处理的细胞(P＜0.001)。　　体内实验发现,和对照组相比,Oct4过表达组的裸鼠皮下瘤增长更快,其增长曲线明显高于对照组:肿瘤细胞裸鼠皮下接种第四周,对照组的裸鼠皮下瘤体积为1.769±0.235mm3,而Oct4过表达组0.589±0.18cm3,差异显著(P=0.0011)　　[结论]体外实验表明,Oct4可以促进细胞增殖,增加细胞的侵袭和转化能力,提高HCC细胞对化疗药物的抵抗能力;体内实验表明,Oct4可以促进HepG2细胞在裸鼠皮下成瘤。　　三、Oct4影响HCC细胞生物活性的机制研究　　[目的]研究Oct4过表达对肝癌干细胞标记物Epcam、Vimentin、ELF和KLF4、CD44和CD133表达的影响;研究Oct4过表达对HCC细胞抗药性的影响;探讨Oct4对肿瘤和干细胞相关信号通路(IL-6/survivin、TGF-beta/和Wnt/beta-catenin)的影响。　　[方法](1)采用Werstemblot和Elisa实验检测肿瘤相关信号通路和干细胞相关信号通路的变化。(2)采用RT-PCR分析肿瘤干细胞相关因子的表达情况。(3)采用流式细胞仪检测CD44和CD133阳性的细胞。(4)利用Werstemblot检测Oct4过表达的细胞与5-Fu抗性细胞信号通路的表达情况。　　[结果](1)Western Blot检测结果发现Oct4过表达后,磷酸化的AKT、JAK、stat3和ERK其表达水平明显增高,Survivin、OPN以及beta-catenin的表达也是上调的,但是E-cadeherin的表达是下降的。(2)Elisa检测了肿瘤相关分泌蛋白的表达,发现IL-6、MPP2和MPP9的表达是上调的,TGF-beta的表达下调。(3)RT-PCR结果表明,Oct4过表达后,Vimentin、ELF和KLF4等干细胞因子的表达水平显著升高。(4)流式细胞仪检测发现,Oct4过表达后,CDl33,CD44阳性的细胞明显增加。(5)和对照细胞相比,Oct4过表达的细胞与5-Fu抗性细胞表达的主要信号分子是一致的。　　[结论]Oct4可能通过上调干细胞相关信号通路,诱导生成更多的HCC肿瘤干细胞,增加细胞对化疗药物的抗性,促进HCC。