第一部分叶酸受体3在CML停药患者骨髓中差异表达及其对CML-LSC的作用目的:酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的开发和应用极大的改善了慢性髓系白血病（CML）患者预后,但是长期服药伴随着沉重的经济负担和药物副作用,一些达到长期深度分子学缓解（DMR）的患者迫切追求停药。但是各大研究中心的停药结果一致提示仅有50%的患者停药后达到无治疗缓解（TFR）,并且还没有指标可以准确地预测和干预复发。目前的主流观点认为CML停药后复发的关键在于TKI不能清除静息的白血病干细胞（LSC）。基于此我们本部分从停药后复发和不复发患者骨髓入手进行研究,寻找骨髓中差异表达的基因并探索其对CML-LSC和K562白血病细胞的作用。方法:遵循知情同意的原则下,收取准备停药的CML患者骨髓标本,进行转录组测序,通过表达量统计和体细胞变异扫描筛选出差异表达基因,在生物信息数据库中寻找差异基因叶酸受体3（FOLR3）和CML预后及其他肿瘤性疾病之间的关系;收集不同阶段CML患者骨髓或外周血标本,Sanger测序检测FOLR3 SNP在CML人群中的表达;在体内外进行以下实验研究FOLR3 SNP的生物学作用:磁珠分选初治CML患者骨髓CD34+细胞,通过慢病毒转染构建差异表达FOLR3 SNP的LSC和K562细胞,嘌呤霉素筛选构建成功的细胞;qRT-PCR检测细胞内FOLR3的表达;克隆形成实验（分别在甲基纤维素和低熔点琼脂糖中）检测细胞的克隆形成能力;无叶酸培养基培养差异表达FOLR3 SNP的K562细胞后检测其克隆形成能力;PI单染流式检测细胞周期;Annexin V-FITC/PI染色流式检测并分析LSC和K562细胞凋亡比例;EdU探针插入检测细胞内DNA合成;MTT法检测细胞增殖;高效液相质谱检测细胞的代谢表达谱;裸鼠皮下成瘤实验检测差异表达FOLR3 SNP的K562细胞成瘤能力,随后进行小动物¹⁸F-FDG标记的PET检测肿瘤的代谢情况。结果:对转录组数据进行生物信息学分析发现不复发CML患者骨髓中高表达FOLR3,FOLR3同源基因FOLR1和FOLR2在两组中表达没有差异;FOLR3在正常骨髓和外周血中均高表达;数据库信息检索发现高表达FOLR3的患者TKI治疗缓解率较低表达的患者高;在TCGA数据库其他肿瘤性疾病中,高表达FOLR3的患者总体生存较差;通过体细胞变异筛选我们还发现不复发患者FOLR3都存在rs139130389 SNP突变,突变和FOLR3的表达量呈正相关;Pfam domain软件预测突变的FOLR3可以编码功能完整的叶酸受体蛋白,野生型FOLR3编码的叶酸受体功能不完整;FOLR3 SNP在低等生物鱼、鼠和鸟类中出现频率较高,在高等生物如人和大猩猩等中反而较低;FLOR3 rs139130389 SNP突变基因型在各人种中出现的平均比例是11.1%,我们收集CML标本Sanger测序结果显示FOLR3 SNP在CML人群中的比例是8.93%;我们的转录组分析还提示FOLR3在复发和不复发患者骨髓免疫细胞组分中表达无差异,所以后续体内外实验主要在LSC中进行;体外细胞实验发现FOLR3 SNP+LSC和K562细胞增殖能力和细胞周期活跃,克隆形成能力增强,克隆形态以红系集落为主;FOLR3SNP-组和siFOLR3组LSC和K562细胞增殖较慢,细胞周期阻滞,克隆形成能力降低;但是FOLR3 SNP不影响细胞的凋亡和DNA合成;用无叶酸培养基培养差异表达FOLR3 SNP的K562细胞可以消除FOLR3 SNP对K562细胞克隆形成能力的促进作用,表现在克隆体积较小,各组间克隆计数无显著差异;质谱检测细胞代谢物显示FOLR3 SNP+和FOLR3 SNP-LSC中差异的代谢物有软脂酸,棕榈酰胺和苯甲酰,差异代谢物主要富集在线粒体中脂肪酸延长、脂肪酸合成和脂肪酸代谢通路;FOLR3SNP+和FOLR3 SNP-K562细胞中差异显著的代谢物有甘油三磷酸、戊氨酸和脱氧二磷酸鸟苷酸等,差异代谢物主要在甘油脂类代谢、甘油磷脂代谢和脂肪酸合成通路中富集;体内裸鼠成瘤中,FOLR3 SNP-组肿瘤体积较大,但是随着成瘤时间的延长差异表达FOLR3 SNP的四组之间瘤体积差异没有统计学意义;小动物PET显示FOLR3SNP+组肿瘤对¹⁸F-FDG的摄取最强,是对照组的1.33倍,siFOLR3组的1.65倍（p=0.0663）,FOLR3 SNP-组的1.82倍（p=0.0579）。结论:FOLR3 SNP在不复发患者骨髓中高表达,FOLR3高表达的患者对TKI治疗反应较好,但是在其他肿瘤疾病中高表达FOLR3的患者总体生存时间短,说明FOLR3在CML疾病中的作用是特异的,是肿瘤异质性的表现,有望作为CML停药监测和患者分层治疗的指标。体外细胞实验中FOLR3 SNP可以促进CML-LSC增殖和分化,活跃其细胞周期,促进细胞内的脂质代谢;叶酸剥夺实验证明FOLR3通过增加细胞对叶酸的摄取促进白血病细胞分化;在体实验也证明FOLR3 SNP促进皮下成瘤模型中肿瘤的代谢。第二部分体外实验探索叶酸受体3影响CML-LSC功能的机制目的:LSC的生存不依赖BCR-ABL1酪氨酸激酶活性并处于静息状态,所以不能被TKI所清除,LSC的持续存在导致CML耐药、治疗抵抗和停药后复发。停药前大部分患者均可检测到CML-LSC残留,但停药后复发与TFR的患者CML-LSC的数目并未见统计学差异。最有可能的解释是不同患者体内LSC功能状态存在差异。因此,停药机制探讨的核心在于复发患者与TFR患者的CML-LSC功能差异何在。我们在前期基础上进一步探讨FOLR3 SNP影响LSC分化的机制,持续分化的LSC的结局及其与停药后TFR之间的关系。方法:遵循知情同意的原则下,收取初治CML患者骨髓,磁珠分选其中的CD34+细胞;病毒转染构建差异表达FOLR3 SNP的LSC和K562细胞,送转录组测序,对测序结果进行表达量统计筛选表达差异的基因,并分析差异基因所富集的通路或生物学途径;具体分析差异生物学过程中关键基因的表达情况;体外在差异表达FOLR3 SNP的LSC和K562中通过以下方法验证测序结果:透射电镜观察细胞的超微结构;Seahorse XF系统检测细胞线粒体氧耗量来反应线粒体功能;JC-1探针流式检测线粒体膜电位;MTG示踪探针检测细胞线粒体质量;通过DCFH-DA标记检测细胞内活性氧水平;荧光素酶实验检测细胞内ATP合成;q RT-PCR检测细胞内衰老相关基因的m RNA表达;甲基纤维素或低熔点琼脂糖检测细胞的克隆形成能力;MTT法检测细胞增殖;PI单染流式分析细胞周期;尝试用药物处理K562细胞筛选可以提升线粒体活性的药物。结果:转录组测序结果显示在FOLR3 SNP+LSC中得到了428个差异表达的基因（220个上调和208个下调）。将这些基因进行GO富集分析主要富集在线粒体相关通路,包括ATP水解、ATP酶活性等。FOLR3 SNP-LSC中差异表达的基因也在线粒体相关条目富集,如线粒体内氧化还原过程和线粒体生物合成途径等;FOLR3 SNP+K562细胞中差异表达的370个基因也在线粒体相关通路富集,如线粒体转录和电子传递活性等。另外FOLR3 SNP+K562细胞中13个线粒体蛋白编码基因的表达也显著上调;针对线粒体活性分析,FOLR3 SNP+LSC样本中线粒体、氧化磷酸化和ATP合成酶活性都较FOLR3 SNP-和si FOLR3组高。电镜结果显示FOLR3 SNP+LSC和K562内线粒体数量明显增多,线粒体嵴面积增加,并且FOLR3 SNP+K562细胞中有脂滴出现;线粒体压力测试中FOLR3 SNP+LSC/K562的氧耗率较对照组、si FOLR3组和FOLR3 SNP-组高。就单个指标而言,FOLR3 SNP+LSC中最大呼吸能力和剩余呼吸能力较其余三组显著增加。在K562细胞中,FOLR3 SNP+组的最大呼吸能力和质子漏显著增加。FOLR3 SNP+LSC中线粒体膜电位升高,但是在K562细胞中没有差异;FOLR3 SNP+LSC和K562细胞中ATP浓度均较对照组显著增加;FOLR3 SNP+K562细胞中线粒体质量较si FOLR3和FOLR3 SNP-组均明显增加;FOLR3 SNP+LSC中丝氨酸羟甲基转移酶2（SHMT2）的表达较对照组、FOLR3 SNP-和si FOLR3组显著升高;我们从5种药物地西他滨、二甲双胍、阿卡地辛、吡格列酮和辅酶Q10中筛选出地西他滨和阿卡地辛可以提升K562细胞内ATP合成;持续分化的FOLR3 SNP+LSC克隆形成能力下降,FOLR3 SNP-和si FOLR3组克隆数较FOLR3 SNP+组显著增加;FOLR3 SNP+LSC的增殖减弱,细胞周期阻滞,细胞内活性氧水平明显升高;FOLR3SNP+LSC中,细胞衰老相关分泌表型基因IL-6和MMP9 m RNA水平显著升高,细胞周期相关基因Cyclin E2表达下降,线粒体未折叠蛋白应答相关基因SIRT7表达下调。结论:转录组测序分析FOLR3 SNP+LSC和K562细胞中差异表达的基因一致富集在线粒体相关生物学途径中,表明FOLR3 SNP极有可能通过活化线粒体功能促进LSC和K562细胞的增殖、细胞周期和分化;细胞实验也证实了FOLR3 SNP+细胞中线粒体功能活跃,包括线粒体数目增加、线粒体内氧耗量增加、线粒体膜电位增加、线粒体质量增加及细胞内ATP合成增加;地西他滨和阿卡地辛可以提升白血病细胞线粒体活性,有望成为辅助FOLR3 SNP阴性患者实现停药后不复发的药物;持续分化的FOLR3 SNP+LSC出现复制性衰老表型为停药相关的细胞研究提供新思路,有利于疾病的停药后监测和个体化治疗。活化线粒体功能诱导细胞分化进而衰老也为可能是清除CML-LSC的新方法。