目的 新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属副粘病毒科Avulavirus属，为单股负链RNA病毒，能感染多种人类肿瘤细胞且不依赖于肿瘤细胞增殖而独立复制，选择性杀伤肿瘤细胞。已有的研究结果表明，不同毒力的NDV对肿瘤细胞的杀伤作用及效应不同，国外研究发现NDV溶瘤株(73-T、PV 701及MTH-68/H等)比非溶瘤株抗肿瘤作用更加强大而有效，而国内则多对疫苗株LaSota等进行研究，尚未见NDV溶瘤毒株筛选工作的文献报道。我们对17株NDV抗肝癌细胞效应进行比较，期望能从中筛选到对肝癌细胞有高效杀伤作用的新城疫病毒溶瘤株。为应用病毒治疗恶性肿瘤部分研究提供新的线索。 材料和方法 选取11株江西鄱阳株NDV，5株广西株NDV(均由汕头大学流感中心鉴定提供)及1株香港株NDV(香港大学医学院分离鉴定提供)，接种鸡胚扩增病毒，48小时后收取鸡胚尿囊液。血凝效价≥1：2048后，将标本保存于-80℃冰箱。常规方法复苏培养3株人传代肝癌细胞(HepG-2细胞，SMMC-7721细胞，Bel-7404细胞)及1株人传代正常肝细胞(HL-7702细胞)，用MTT法检测以上病毒对肝癌细胞的杀伤作用。初步筛选出对肝癌细胞杀伤作用强的两株病毒，经过肿瘤细胞扩增传代后，用Vero-E6细胞连续3次作蚀斑纯化，得到纯化病毒后再次鸡胚扩增，用纯化病毒对3株人传代肝癌细胞(HepG-2细胞，SMMC-7721细胞，Bel-7404细胞)进行细胞学实验，MTT法、PFU及TCID50检测病毒对细胞的杀伤效率。 取筛选纯化的这两株NDV毒株进行下一步的分子生物学实验。用RNA试剂盒提取病毒RNA后，逆转录合成cDNA。用针对F基因片段设计的特异性引物，进行PCR反应扩增。将扩增产物与载体pGEM-T连接，转化到大肠杆菌EPI-100中，用蓝白斑筛选实验和菌落PCR法挑选出阳性克隆，将测序结果与基因库中国际标准NDV毒株的F基因同源性、疏水性、抗原表位等比较分析，绘制系统发育进化树，确定这两株病毒的生物学特性。 结果 1．试验中17株NDV对3株人传代肝癌细胞(HepG-2细胞，SMMC-7721细胞，Bel-7404细胞)都有显著的杀伤作用，对人传代正常肝细胞(HL-7702细胞)作用小(两组数据有显著性差异，P<0.05)。 2．试验所有NDV对肿瘤细胞的细胞毒作用随病毒浓度提高而增强，与病毒作用细胞时间成正相关。 3．筛选出2株NDV(7793株、D817株)对肝癌细胞有较强杀伤性，感染肿瘤细胞72h后可引起80％左右细胞死亡，但是对人正常肝细胞72h后杀伤率低于5％。 4．NDV 7793株与NDV D817株具有选择性在肝癌细胞中快速复制增殖的能力，是正常肝细胞中病毒生长的256～512倍。 5．NDV D817株和NDV 7793株体外抗肿瘤作用相比，统计学分析无明显差异性。 6．经过肝癌细胞传代扩增后的NDV抗肿瘤作用有明显的提高。 7．与已发表的8株国际标准NDV F蛋白基因测序比较，核苷酸序列同源性在79．8％～92．4％之间，推导出的氨基酸同源性在89.7％～95.5％之间。系统发育树分析NDV 7793株与基因Ⅰ型国际标准弱毒株Ulster株有较近的亲缘关系；NDV D817株和基因Ⅵ型国际标准株Iraq-AG-68处于同一遗传进化分枝。 8．F蛋白抗原性分析显示，NDV 7793株与疫苗株La Sota，有明显差异。 9．NDV 7793株F蛋白裂解位点的氨基酸序列是<112>G-K-Q-G-R-L<117>，抗原性及疏水性分析表明具有弱毒株NDV的分子特征，D817为<112>R-R-Q-K-R-F<117>，抗原性及疏水性分析具备强毒株NDV的分子特征。 结论 1．试验所选17株NDV具有选择性在肿瘤细胞中复制增殖和杀伤肿瘤细胞的作用，具备抗肿瘤生物治疗的潜能；其中筛选出两株NDV：7793株和D817株具有较强的抗肿瘤效应。 2．WDK/JX/7793/2004株NDV属于基因Ⅰ型弱毒力病毒株，为非溶瘤株；DK/HK/817/1980株NDV属于基因Ⅵ型强毒力病毒株，为溶瘤株。 3．NDV 7793株与疫苗株La Sota不同，非疫苗扩散株。 4．NDV 7793株具有较强的选择性杀伤肝癌细胞的作用，且为弱毒力病毒株，从生物治疗的安全性及有效性考虑，这株病毒更具备抗肿瘤生物治疗的潜能。