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第一部分280nm LED紫外线对鼠白血病细胞L1210及造血干/祖细胞影响的体内外研究目的:体外净化是自体造血干细胞移植治疗的关键,本研究以280nm LED紫外线(ultraviolet LED,UV LED)为研究对象,观察280nm UV LED对鼠白血病细胞L1210及造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cell,HSPC)的体内外影响。方法:1.造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的分选:获取小鼠的骨髓细胞,采用生物素或PE标记的SCA1抗体,经免疫磁珠分选得到HSC,流式细胞仪检测HSC的纯度。2.UV LED对两种细胞集落形成的影响:L1210细胞及HSC经0、2.4、4.8、7.2、9.6、12、14.4、16.8、19.2J/m2的UV LED照射后,接种于Metho Cult?GF M3434甲基纤维素培养基中,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下分别培养8、12天,计数集落的数量。3.UV LED对两种细胞增殖的影响:L1210细胞及HSC经0、28、56、112、224J/m2的UV LED照射后,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养3 h、6 h、12 h、24 h,采用CCK-8检测两种细胞的增殖情况。4.UV LED对两种细胞凋亡的影响:L1210细胞及HSC经0、28、56、112、224J/m2的UV LED照射后,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养3 h、6 h、12 h、24 h(检测HSC凋亡时只培养24 h),采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测两种细胞的凋亡情况。5.UV LED对外周血HSC移植的影响:受鼠(雌鼠)移植前接受9 Gy X线全身照射的清髓性预处理,将2×107个DBA/2雄鼠骨髓细胞经0、9.6J/m2的UV LED照射后通过尾静脉注入受鼠体内,观察两组小鼠的生存率(观察时间为90天)、血常规(d7、d14、d21、d42、d60)及移植后d60外周血、骨髓细胞、脾脏DNA中sry基因表达情况。6.UV LED对L1210细胞体内局部致瘤能力的影响:将2×105个L1210细胞经0、224J/m2的UV LED照射后注入DBA/2雌鼠的左前肢腋下,观察两组小鼠的肿瘤生长情况、生存率(观察时间为90天)及组织病理学形态。7.UV LED对L1210细胞体内血行转移能力的影响:受鼠(雌鼠)移植前接受2 Gy X线全身照射+环磷酰胺的非清髓预处理,将2×105个L1210细胞经0、9.6J/m2的UV LED照射后与2×107个DBA/2雄鼠骨髓细胞混合,经尾静脉注入受鼠体内,观察两组小鼠的一般情况、生存率(观察时间为90天)、骨髓细胞甩片及组织病理学形态。结果:1.HSC的纯度:采用PE标记的SCA1抗体经免疫磁珠分选得到HSC(PE阳性),经流式细胞仪检测纯度高达97.1%。2.UV LED对两种细胞集落形成的影响:UV LED在0-19.2J/m2的剂量范围内可显著抑制CFU-L1210、CFU-HPC(P均<0.01),并呈剂量依赖性。在2.4-14.4J/m2的剂量范围内,UV LED对CFU-L1210的抑制作用明显强于对CFU-HPC的作用(P均<0.05),以9.6J/m2最为显著。3.UV LED对两种细胞增殖的影响:在0-224J/m2照射剂量、孵育时间3-24h范围内,UV LED可显著抑制L1210细胞及HSC的增殖(P均<0.05),并呈剂量与时间依赖性。除照射剂量为28J/m2、孵育3h时HSC与L1210细胞的增殖率无显著性差异外(t=1.28,P=0.27),其余各组UV LED对L1210细胞的增殖抑制作用明显强于对HSC的作用(P均<0.05)。4.UV LED对两种细胞凋亡的影响:在0-224J/m2照射剂量、孵育时间3-6h范围内,UV LED照射不能显著增加L1210细胞的凋亡率(P均>0.05);当孵育时间延长到12h及24h时,UV LED可使L1210细胞的凋亡率显著增加(P均<0.05),并呈剂量与时间依赖性;照射剂量为224J/m2、孵育24h时L1210细胞的凋亡率达到最高。在56-224J/m2照射剂量、孵育24h时,UV LED可诱导HSC的凋亡(P均<0.05),但无剂量依赖性。UV LED在0-224J/m2照射剂量、孵育24h时对L1210细胞凋亡的诱导作用明显强于对HSC的作用(P均<0.01),以224J/m2最为显著。5.UV LED对外周血HSC移植的影响:对照组小鼠除1只于d4死亡外,余小鼠及实验组小鼠存活时间均>90天,两者生存率比较无统计学差异(X2=1.00,P=0.32);两组小鼠d7、d14、d21、d42、d60的WBC、RBC、Hb及PLT比较均无统计学差异(P均>0.05),至d14两组小鼠的造血功能均恢复正常;移植后d60两组小鼠的外周血、骨髓细胞及脾脏DNA中均可检测到sry基因,即供鼠细胞在受鼠体内达到稳定嵌合状态。6.UV LED对L1210细胞体内局部致瘤能力的影响:对照组小鼠的成瘤率达100%,至d21全部死亡,而实验组小鼠均未出瘤,存活时间均>90天,生存率明显高于对照组小鼠(X2=11.76,P=0.00);对照组小鼠的脾脏中可见白血病细胞浸润,而实验组小鼠的各器官中均未见白血病细胞。7.UV LED对L1210细胞体内血行转移能力的影响:对照组小鼠d21出现体重持续下降,d52相继出现精神萎靡、饮食不佳、弓背、皮毛无光泽并脱毛、呼吸困难、双下肢瘫痪,最终进展到恶病质并死亡,解剖发现脾脏较同期实验组小鼠明显肿大,中位生存期为56天;实验组小鼠d28出现体重持续下降,d80相继出现上述症状,中位生存期为84天,生存率明显高于对照组小鼠(X2=12.02,P=0.00);对照组濒死小鼠的脾脏、股骨骨髓、椎体、脊髓及硬膜外腔可见白血病细胞浸润,而实验组濒死小鼠在椎体、脊髓及硬膜外腔中发现白血病细胞,其余各脏器均未见白血病细胞。与对照组相比,实验组小鼠的白血病发病晚,且白血病细胞浸润程度轻。结论:1.280nm UV LED体外可选择性杀伤白血病细胞L1210,并具有剂量-时间依赖效应,其机制包括抑制集落形成、抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡,而对HSC的影响较小。2.280nm UV LED具有体外净化的作用,UV LED照射后的L1210细胞体内局部致瘤及血行转移的能力显著下降,小鼠白血病发病晚且白血病细胞浸润程度轻,而UV LED照射后的HSC在体内仍保留造血重建的能力。第二部分蛋白激酶在UV LED诱导的L1210细胞凋亡中的作用目的:UV诱导的细胞凋亡是由多条信号通路参与的高度复杂的生物学过程,其中蛋白激酶家族在凋亡信号通路中发挥重要作用。本研究通过观察280nm UV LED对PKA、PKCβ基因、蛋白等表达的影响,探讨PKA、PKCβ在UV LED诱导的L1210细胞凋亡中的作用。方法:以0(对照组)、224J/m2(实验组)的UV LED照射L1210细胞,于37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下培养24 h。采用RT-q PCR的方法检测prkacb、prkcb基因的m RNA表达、Western blot检测PKA、PKCβ的蛋白表达、焦磷酸测序检测prkacb、prkcb基因的甲基化水平。将L1210细胞分别与10μM PKA的抑制剂KT5710及5μM PKCβ的抑制剂Enzastaurin共同孵育12h,各对照组细胞均与等量的DMSO共孵育12h,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果:1.两组细胞prkacb、prkcb基因m RNA的表达量:以对照组prkacb、prkcb的m RNA表达量为参照(看作1),实验组prkacb的m RNA表达量为(0.22±0.03),明显低于对照组(t=51.06,P=0.00);实验组prkcb的m RNA表达量为(0.39±0.04),明显低于对照组(t=26.41,P=0.00)。2.两组细胞PKA、PKCβ蛋白的表达量:对照组、实验组PKA的蛋白表达量分别为(1.04±0.15)、(0.37±0.06),两组比较有统计学差异(t=8.25,P=0.00);对照组、实验组PKCβ的蛋白表达量分别为(1.18±0.12)、(0.53±0.04),两组比较有统计学差异(t=10.62,P=0.00)。3.两组细胞prkacb、prkcb基因的甲基化水平:对照组、实验组prkacb基因两个位点的甲基化水平分别为(85.33±1.51)%、(86.17±1.17)%;(84.33±2.58)%、(82.33±1.37)%,两组比较均无统计学差异(P均>0.05)。对照组、实验组prkcb基因九个位点的甲基化水平分别为(97.00±0.63)%、(97.17±0.75)%;(95.67±1.37)%、(95.67±1.51);(92.83±0.41)%、(93.17±0.41)%;(90.00±0.41)%、(90.33±1.37)%;(95.67±3.93)%、(96.17±2.93)%;(85.33±0.52)%、(85.50±0.84)%;(93.17±1.72)%、(93.17±0.75)%;(96.17±0.75)%、(96.67±0.52)%;(96.50±0.55)%、(96.17±1.17)%,两组比较均无统计学差异(P均>0.05)。4.KT5720对L1210细胞凋亡率的影响:实验组细胞与10μM溶于DMSO的KT5720共孵育12h,而对照组细胞与等量DMSO共孵育12h,对照组、实验组细胞的凋亡率分别为(8.69±0.34)%、(39.66±8.56)%,两组比较有统计学差异(t=6.26,P=0.02)。5.Enzastaurin对L1210细胞凋亡率的影响:实验组细胞与5μM溶于DMSO的Enzastaurin共孵育12h,而对照组细胞与等量DMSO共孵育12h,对照组、实验组细胞的凋亡率分别为(6.77±0.46)%、(17.11±1.29)%,两组比较有统计学差异(t=13.07,P=0.00)。结论:1.PKA、PKCβ在L1210细胞中发挥抗凋亡作用。2.280nm UV LED可降低L1210细胞prkacb、prkcb基因的m RNA及PKA、PKCβ的蛋白表达,参与UV LED诱导的细胞凋亡。3.280nm UV LED诱导的prkacb、prkcb基因m RNA表达的降低是通过非DNA甲基化修饰的机制完成。