西瓜MAPK和MAPKK家族基因的鉴定、表达模式和功能分析

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植物在整个生命过程中,不断遭受外界环境的各种胁迫。逆境胁迫严重影响了植物的生长发育,为了应对这些胁迫,植物进化出了一套精细调控的信号传导网络。促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPK)级联途径在真核生物中十分保守,它是一种十分重要的信号传导系统。MAPK级联途径包括三个级别的功能蛋白激酶,分别是MAPKKK、MAPKK和MAPK。MAPK级联通过将胞外信号逐级放大并传递至细胞内,在调控植物的许多生理生化过程中起重要作用。西瓜是一种双子叶开花植物,耐旱喜温,在我国大多数地区均有种植。相比拟南芥和水稻,有关西瓜中MAPK、MAPKK的报道十分有限,相关的研究还不够深入。运用生物信息学方法,利用已经公开的西瓜基因组数据库,本研究鉴定了西瓜中15个MAPK基因(CIMPKs)和6个MAPKK基因(ClMKKs),并对它们进行了命名、分类、系统进化树构建、蛋白序列比对、保守结构域分析、染色体定位、表达模式分析、蛋白互作分析及抗病功能研究。主要研究结果如下:(1)利用拟南芥中MAPK、MAPKK家族成员蛋白序列的同源搜索,在西瓜基因组中鉴定到15个MAPK和6个MAPKK基因。蛋白序列比对、保守基序和系统进化树分析结果表明,西瓜中MAPK、MAPKK成员也可以分为A、B、C、D四个亚组。染色体定位分析显示,(ClMPKs和ClMKKs的21个基因分布在西瓜的10条染色体上。从进化角度看,有些西瓜MAPK和MAPKK基因涉及到串联复制,部分则产生于染色体片段复制事件。(2)通过qRT-PCR技术分析了西瓜中21个MAPK、MAPKK基因在根、茎、叶等不同组织器官,干旱、高盐、低温、高温等非生物胁迫,ABA、SA、 JA、ACC等激素诱导和西瓜枯萎菌侵染时的表达模式,结果表明:ClMPK19、 CIMPK7、CIMKK6在组织特异性表达中差异极显著;干旱处理后,CIMPK4-2、CIMPK7的表达量明显高于其他基因;盐处理后,只有ClMPK7响应胁迫,其他基因的表达量无明显变化;低温处理后,ClMPK7、CIMPK9-1、CIMPK9-2、 ClMPK9-4下调表达量远远高于其他基因;高温处理后,CIMPK7、CIMPK20-1、 ClMPK9-4上调表达量较其他基因高;在西瓜枯萎菌侵染后第9d时,CIMPK3、 ClMPK7、CIMKK5的表达量分别为对照的9倍、13倍和6倍。CIMPK7在各种处理中的表达量均显著高于其他基因,同时,该基因在干旱胁迫、高温胁迫、ABA诱导时高度上调,而在低温胁迫时高度下调,这说明了ClMPK7很有可能同时参与了多条不同的信号转导途径,并在其中扮演关键角色。(3)采用酵母双杂交技术分析西瓜中8个MAPK基因和5个MAPKK基因的蛋白互作情况,结果表明:ClMPK4-1不仅可以和ClMKK2-1发生互作,还能与(l1MKK6、ClMKK9发生互作;此外,ClMKK2-1也可以同时与ClMPK4-1、 C1MPK4-2、ClMPK13互作。一个MAPK蛋白可以同不止一个MAPKK蛋白互作,而一个MAPKK蛋白也可以和多个MAPK蛋白互作,从而我们推测西瓜中MAPK与MAPKK之间存在着一种复杂的交叉相互作用,这进一步揭示了MAPK级联途径在信号转导中的多样性。(4)利用农杆菌介导的瞬间表达技术,我们将西瓜中14个MAPK、MAPKK基因在本氏烟中瞬时表达后接种灰霉菌,用于检测基因的抗病功能。结果表明,ClMPK7瞬时表达后可以诱导防卫基因的表达和活性氧的积累,从而减轻灰霉菌对本氏烟的侵害。另外,ClMPK7还可以诱导过敏性坏死反应。
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