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目的:溃疡性结肠炎(UC)是一种漫及结直肠的慢性非特异性炎症,以长期持续或间断发作的腹泻、粘液脓血便等为主要临床症状。中医理论认为UC是以脾胃虚弱为本,以湿热蕴结、瘀血阻滞为标引起的胃肠功能失调。溃结灵是依循清热健脾活血法构建的治疗UC的中药复方。溃结灵在临床研究中表现出了良好的疗效,但作用机制未完全明确。在前期研究中,溃结灵能通过调节Treg/Th17细胞平衡缓解三硝基苯磺酸诱导的大鼠结肠炎症。调节性T细胞(Treg)由转化生长因子β(TGF-β)诱导CD4+T细胞分化而来,分泌白细胞介素10(IL-10)参与维持人体正常的免疫耐受,辅助性T细胞17(Th17)由TGF-β和IL-6联合诱导CD4+T细胞分化而来,分泌IL-17和IL-21,参与了多种自身免疫性炎症的发展。抑炎的Treg细胞减少,促炎的Th17细胞增多、Treg/Th17细胞平衡被打破是UC发病机制中的重要一环。叉头样蛋白p3(Foxp3)和视黄酸相关孤儿受体γt(RORγt)分别是Treg细胞和Th17细胞分化的特异性转录因子,信号转导与转录激活因子3(STAT3)和信号转导与转录激活因子5(STAT5)信号通路是决定CD4+T细胞向Treg细胞还是Th17细胞分化的最重要的胞内信号通路。本课题旨在通过建立体外Treg/Th17细胞失衡模型,检测溃结灵含药血清对Treg和Th17细胞比例、功能和分化的作用,在细胞水平验证溃结灵对Treg/Th17细胞平衡的调节作用,并检测溃结灵含药血清对淋巴细胞STAT3信号通路、STAT5信号通路和Treg/Th17分化相关细胞因子的影响,进一步探讨其可能的作用机制。方法:1.密度梯度离心法分离大鼠外周血淋巴细胞,并用抗CD3抗体与抗CD28抗体刺激其中的T细胞活化增殖。使用10%、5%、2.5%溃结灵含药血清对其进行干预作用12h、24h、48h,然后用MTT细胞增殖活性检验检测溃结灵含药血清对体外T细胞活化增殖的影响。2.密度梯度离心法分离大鼠外周血淋巴细胞,使用抗CD3抗体、抗CD28抗体、TGF-β 1、IL-6和IL-23刺激其中的T淋巴细胞向Th17细胞极化,建立体外Treg/Th17细胞失衡模型。采用流式细胞技术检测Treg和Th17细胞占CD4+T细胞比例的变化。分别使用10%、5%、2.5%溃结灵含药血清对其进行干预作用48h,流式细胞技术检测溃结灵含药血清对Treg和Th17细胞占CD4+T细胞比例的影响。3.TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用诱导Treg/Th17细胞失衡,分别使用10%、5%、2.5%溃结灵含药血清对其进行干预作用48h,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测溃结灵含药血清对细胞培养上清液中IL-10、IL-17和IL-21浓度的影响,实时荧光定量逆转录PCR检测溃结灵含药血清对IL-10、IL-17和IL-21 mRNA表达的影响。4.TGF-β1、IL-6和IL-23联合作用诱导Treg/Th17细胞失衡,分别使用10%、5%、2.5%溃结灵含药血清对其进行干预作用48h,流式细胞技术检测溃结灵含药血清对RORγt和Foxp3蛋白表达的影响,实时荧光定量逆转录PCR检测溃结灵含药血清对ROR γ t和Foxp3 mRNA表达的影响。5.TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用诱导Treg/Th17细胞失衡,分别使用10%、5%、2.5%溃结灵含药血清对其进行干预作用48h,流式细胞技术检测溃结灵含药血清对STAT3、p-STAT3、STAT5和p-STAT5蛋白表达的影响,实时荧光定量逆转录PCR检测溃结灵含药血清对STAT3和STAT5 mRNA表达的影响。6.TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用诱导Treg/Th17细胞失衡,分别使用10%、5%、2.5%溃结灵含药血清对其进行干预作用48h,实时荧光定量逆转录PCR检测溃结灵含药血清对IL-6、IL-23和TGF-β1mRNA表达的影响。结果:1.使用10%、5%和2.5%溃结灵含药血清作用12h、24h、48h均对抗CD3抗体、抗CD28抗体诱导的体外T淋巴细胞活化增殖无显著影响。2.TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用48h后,Treg细胞占CD4+T细胞比例显著降低,Th17细胞占CD4+比例显著升高,Th17细胞/Treg细胞的比值显著升高,构建出Treg/Th17细胞失衡模型。使用10%、5%或2.5%溃结灵含药血清干预能显著升高Treg细胞占CD4+T细胞比例,降低Th17细胞占CD4+比例,降低Th17细胞/Treg细胞比值。3.TGF-β1、IL-6和IL-23联合作用48h后,细胞培养上清液中IL-10、IL-17和IL-21浓度无显著变化,细胞IL-10 mRNA表达量下降,IL-17和IL-21的mRNA表达量升高。使用溃结灵含药血清进行干预能提高细胞IL-10 mRNA的表达量,降低IL-17和IL-21 mRNA的表达量,对细胞培养上清液中IL-10、IL-17和IL-21浓度无显著影响。4.TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用48h后,淋巴细胞的RORγ t蛋白表达量和mRNA表达量上升,Foxp3蛋白表达量和mRNA表达量下降。使用溃结灵含药血清进行干预能提高淋巴细胞的Foxp3蛋白表达,降低ROR γ t蛋白表达,降低RORγt mRNA表达。5.TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用48h后,淋巴细胞的p-STAT3蛋白表达量和STAT3 mRNA表达量上升,STAT3蛋白表达量、STAT5蛋白表达量、p-STAT5蛋白表达量和STAT5 mRNA表达量无显著变化。使用溃结灵含药血清进行干预能降低淋巴细胞的STAT3和p-STAT3蛋白表达,降低STAT3 mRNA表达,提高STAT5和p-STAT5蛋白表达,提高STAT5 mRNA表达。6.TGF-β 1、IL-6 和 IL-23 联合作用 48h 后,细胞 TGF-β 1 和 IL-23 mRNA 的表达量无显著变化,IL-6 mRNA表达量上升。使用溃结灵含药血清进行干预能升高TGF-β 1 mRNA表达量,降低IL-6 mRNA表达量。结论:溃结灵含药血清作用48h对TGF-β 1、IL-6和IL-23联合作用所引起的Treg/Th17细胞失衡与功能异常具有显著调节作用,其作用机制可能与溃结灵含药血清抑制淋巴细胞STAT3磷酸化与基因转录,促进STAT5磷酸化与基因转录,同时调节了淋巴细胞TGF-β 1、IL-6、IL-23的基因表达相关,对Treg细胞和Th17细胞分化与功能的调节作用可能是溃结灵治疗溃疡性结肠炎的作用机制之一。