消退素D1减轻活化小胶质细胞对PC12细胞的毒性作用及机制

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背景与目的急慢性神经退行性疾病(如脑缺血、脑损伤、帕金森病、阿尔茨海默病、多发性硬化症等)是一类以神经元丢失或退行性变性为共同病理特征的复杂疾病,该病无法治愈,且随着时间推移而进行性发展,可导致机体认知、感觉和运动功能障碍。研究证明中枢神经系统内以胶质细胞激活为主的炎症反应是许多神经退行性疾病的重要组成部分。虽然人们对神经元的损失的基本机制还没有完全理解,但目前认为小胶质细胞的激活在其中扮演重要角色。小胶质细胞是中枢神经系统常驻的巨噬样细胞,在外界刺激下,其可释放出促炎性介质及细胞因子,清除病原体及感染细胞,恢复内环境稳态;但是在病理状态下过量的促炎性介质及细胞因子可引起慢性的神经炎症,导致神经细胞的死亡,最终促进各种神经退行性疾病的发生。消退素Dl(Resolvin D1,RvD1)是一种新型促炎性消退脂质介质,在许多炎症相关疾病模型中可发挥有效的治疗作用。本研究选用药物处理后BV-2小胶质细胞的上清液来培养神经性PC12细胞,以此来模拟体内小胶质细胞与神经元相互作用的内环境,旨在观察RvD1是否可减少活化BV-2细胞对PC12细胞的毒性作用及其可能机制。材料与方法细胞培养及分组BV-2小胶质细胞株及PC12神经细胞株常规接种培养,取对数生长期细胞用于实验。实验分组:BV-2细胞分为对照组、LPS(lipopolysaccharide,脂多糖)组、RvD1+LPS组和RvD1组4组。其中对照组细胞加入0.038%的无水乙醇;LPS组细胞先加入0.038%的无水乙醇30min后,加入终浓度为100ng/ml的LPS;RvD1+LPS组细胞先加入100n M RvD1预处理30min后加入终浓度为100ng/ml的LPS;RvD1组细胞加入100n M的RvD1。方法1.BV-2细胞按上述实验分组加药处理,继续培养24h,收集各组上清液待用。将各组上清液分别加入培养24h后的PC12细胞中,继续培养24h。DAPI染色后观察PC12细胞核的凋亡形态学变化。2.CCK-8法检测各组PC12细胞的存活率。3.流式细胞术(Annexin V-FITC/PI试剂盒)测定各组PC12细胞的凋亡率。4.酶联免疫法(ELISA)检测各组BV-2细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度。5.免疫荧光法检测各组BV-2细胞NF-κB p65蛋白的核转位。6.western blot法检测各组BV-2细胞浆及细胞核的NF-κB p65蛋白的表达。统计学分析采用统计软件SPSS 17.0对所有数据资料进行分析处理,符合正态分布的计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多组间的两两比较采用最小有意义差异t检验(LSD)。α=0.05为显著性检验水准。结果1.DAPI染色结果显示,与对照组相比,LPS组PC12细胞核表现出明显的凋亡形态学特征:染色质浓缩、高度凝集、边缘化;RvD1+LPS组细胞核也有部分细胞表现为凋亡形态,但数量明显低于LPS组;RvD1组与对照组相比,无明显差异。2.CCK-8法结果显示,与对照组比较,LPS组PC12细胞存活率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);而与LPS组比较,RvD1+LPS组细胞存活率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);RvD1组与对照组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.流式细胞术结果显示,与对照组相比,LPS组PC12细胞凋亡率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),而与LPS组比较,RvD1+LPS组PC12细胞凋亡率明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);RvD1组与对照组PC12细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。4.LPS刺激BV-2细胞24h后,与对照组比较,LPS组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);而与LPS组比较,RvD1+LPS组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);RvD1组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。5.免疫荧光图片显示,与对照组比较,LPS组细胞NF-κB p65入核显著增加;而RvD1+LPS组细胞与LPS组比较,NF-κB p65入核显著减少;RvD1组与对照组比较,无明显差异。6.Western blot结果显示,与对照组比较,LPS组细胞NF-κB p65入核显著增加,差异有统计学意义(P<0.05);而RvD1+LPS组细胞与LPS组比较,NF-κB p65入核显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);RvD1组与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论RvD1可减轻LPS活化BV-2小胶质细胞对神经性PC12细胞的毒性作用,其机制可能与RvD1抑制活化BV-2细胞炎症介质表达及NF-κBp65的核转位有关。
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