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近年来,纤维素酶在制浆造纸、纺织和洗涤剂工业上得到了广泛的应用。作为工业酶制剂,这些应用一般要求在中性或碱性条件下进行,因此碱性或耐碱性纤维素酶的研究逐渐受到重视。本课题组已经从碱性土样中筛选获得一株耐碱性纤维素酶生产菌株-枯草芽孢杆菌Y106,并将其纤维素酶基因克隆到pUC18质粒上构建重组质粒pUC18-7,在大肠杆菌JM109中获得表达。表达的纤维素酶Cel 18-7与原始菌株产生的酶一样在pH6.0～6.5时CMC酶活力最高,这显然不能满足造纸、纺织、洗涤剂等行业的生产要求。为了适应工业应用的要求,本研究采用体外定向进化和定点诱变的方法对纤维素酶进行分子改造,以期获得碱性条件下酶活提高的耐碱性突变株。本文采用易错PCR技术和致突变菌株技术,建立了纤维素酶突变体文库。使用双层平板检测法和液体酶活验证法对突变体库进行筛选,一共筛选了600个突变体,没有筛到碱性酶活提高的突变体,只获得一株耐酸性突变体(Cel 18-7.12),最适pH为6.0。测序结果显示,纤维素酶第339位的氨基酸由Ile变为Thr,并且发生终止突变造成C-末端25个氨基酸的缺失。为了研究纤维素酶C-末端CBD对酶活性质的影响,设计引物采用PCR方法切除纤维素酶C末端163个氨基酸并命名为CBDcut。对酶活性质进行测定发现,CBDcut酶活力有少量提高,pH性质基本没有变化,由此可以推测纤维素酶的CBD切除之后对酶的酸碱性质没有影响。通过比对Cel 18-7所属的第五家族几个具有代表性纤维素酶的氨基酸序列,发现对应于Cel 18-7212位和140位的氨基酸残基具有高度的保守性,所有碱性纤维素酶在212位都是His,酸性酶都是Asn;在140位碱性纤维素酶都是Ile,酸性酶都是Gln,而Cel 18-7相应位置的氨基酸分别是Asn和His。这种在特定位置高度保守的氨基酸残基很可能对酶的结构与功能起重要作用,尤其与该酶的耐碱性有关。为了研究纤维素酶的耐碱性机理,采用重组PCR技术对Cel 18-7第212和140位的氨基酸残基进行定点突变。第212位由Asn突变为His和Asp,第140位由His突变为Gln,带有突变的基因片段克隆到质粒pUC18上,构建了重组质粒pUC18-7-N212H、pUC18-7-N212D和pUC18-7-H140Q。然后分别对重组质粒在大肠杆菌JM109中表达的未突变和突变的纤维素酶性质进行比较,结果发现Cel 18-N212H最适pH由6.0-6.5偏移到6.5-7.0,碱性条件下酶活提高;Cel 18-N212D最适pH偏移到5.5,碱性条件下酶活降低;Cel 18-H140Q最适pH偏移到5.0,但对酸碱的耐受度提高了。通过同源模建,用Swiss-model服务器构建了重组纤维素酶和各种突变的纤维素酶的三维结构立体图。通过对酶分子结构的分析,检测突变位点氨基酸残基对整个酶分子造成的影响,进一步比较突变位点氨基酸残基的侧链原子与催化残基的羧基氧原子之间的距离变化以及两催化残基之间的距离变化,从活性中心氨基酸残基的带电性能、空间位阻、与催化残基形成的氢键网络的变化等几个方面推测纤维素酶的耐碱机制。本文的研究工作,一方面可为从理论上探讨酶的结构与功能的关系,为酶的耐碱机理研究积累实验数据;另一方面为采用定向进化的方法获得酶的活性和耐碱稳定性提高的突变体,构建高效表达基因工程菌用于工业大生产奠定基础。