拟南芥MYB转录因子超家族的克隆和表达模式分析及AtMYB24的初步功能研究

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在植物中,MYB转录因子家族是成员最多的转录因子家族之一。这一家族的成员广泛地参与到植物生长发育的各个领域,调节生理生化等多方面的反应,在调控植物的细胞周期、调节次生代谢、响应逆境胁迫及激素应答、参与细胞命运决定、控制生物节律、调节花的发育等多方面都具有重要功能。通过对拟南芥全基因组的分析,我们鉴定出了198个MYB基因,其中大多数基因的功能未知。我们克隆了其中的163个基因,并通过western验证了其中的135个基因都可以在酵母中正确表达。我们用Reversenorthern的方法得到了这163个基因在各种组织、各种激素处理和非生物胁迫条件下的表达模式。这些工作为进一步研究MYB家族转录因子的功能提供了平台。 在对MYB家族转录因子进行表达模式分析时我们发现R2R3-MYB家族19亚组的成员特异性地在花中表达,并且在C末端共有一个保守的基序W/Y-MDDIW。通过进一步的搜索比对我们发现单子叶和双子叶植物中有17个MYB蛋白都共有这一类保守基序。带有这一保守基序的蛋白并不全是19亚组的成员。根据保守基序的位置不同,可把带有这一保守基序的成员分为两类,一类的基序位于C端的末尾,一类位于C端的中间。酵母单杂的实验表明,这段保守基序对于这两类MYB蛋白的激活活性都是必需的。RT-PCR实验表明,第一类MYB蛋白主要在花中表达。RT-PCR和GUS染色实验表明,带有这一基序的蛋白的表达受到光的调控。 我们进一步研究了19亚组的成员AtMYB24的功能。AtMYB24是一个核定位蛋白,具有激活活性。Northern实验表明这是一个在花序中特异性表达的基因。原位杂交的实验表明,在花发育早期,AtMYB24在各个花器官中都有表达,在小孢子细胞中的表达水平尤其高。随着花器官的不断发育,表达水平降低,最后仅在胚珠中表达。组成型表达AtMYB24的转基因植株生长得较为矮小,叶片较窄,尤其是花粉的发育会受到较大的影响。亚历山大染色实验表明转基因植株中会产生大量败育的、缺乏细胞质的花粉,甲苯胺兰染色实验表明,花粉发育出现异常的时期是在减数分裂完成之后,在雄配子体发育的10到11期。在组成型表达AtMYB24的转基因植株的花序中,参与花色素合成途径CHS基因和DFR基因的表达被下调了。通过全基因组芯片分析及Real-time定量PCR的进一步验证,发现与磷酸代谢运输有关的酶AtPT2、AtACP5以及参与多种次生代谢途径的2个过氧化物酶和细胞色素P450的表达上调,而亮氨酸合成途径的第一个酶2-异丙基苹果酸合酶3的上调水平最高,表明雄性不育的表型可能与CHS和DFR基因的下调以及过氧化物酶和细胞色素P450的表达的变化有关。综上所述,AtMYB24作为主要在花中表达的转录因子,对雄配子体的正常发育具有重要作用。
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