研究背景急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)是临床常见的危重病症,以重症监护室(intensive care unit, ICU)患者为著。我国流行病学资料显示3.2%的住院人群中合并AKI,而国外报道AKI的发生率甚至接近20%。急性肾损伤与患者的预后关系密切,研究表明ICU患者的AKI死亡率可高达50%以上。而20%-30%的“临床治愈”的AKI患者进入慢性肾功能不全,最终进展为终末期肾病(End stage renal disease, ESRD),需要依赖肾替代治疗。因此,对AKI患者及早诊断、及早干预有着重要的临床意义,直接决定患者的预后。鉴于此,学者们对AKI的发病机制进行大量的研究,希望从发病机制入手,为AKI的诊断及治疗提供新的理论依据。研究证实肾小管上皮细胞死亡的形式直接影响了肾小管上皮的修复,决定患者的预后。传统的观点认为细胞死亡分为两种形式：凋亡和坏死,凋亡是可以调控的,而坏死是不可以调控的。急性肾小管坏死是肾小管上皮死亡的最严重的表现形式。长期以来,人们认为肾小管坏死和其他坏死一样是不可以调控的,无法进行临床干预。因此,对AKI的治疗始终未能突破“肾小管坏死”这一瓶颈。新近发现,细胞坏死也是可以调控,细胞死亡存在一种介于凋亡和坏死之间的中间类型,2009年细胞死亡命名委员会将这一坏死类型命名为1ecroptosis(意译为凋亡样坏死)。凋亡样坏死由细胞膜受体交互作用蛋白1(Receptor interacting proteinl, RIP1)介导。活化RIP1有泛素化和去泛素化两种形式。接受死亡信号后,泛素化RIP1活化caspase-8,启动凋亡；当caspase-8途径受抑制,去泛素化RIP1活化NADPH氧化酶,生成活性氧(reactive oxygen species, ROS),诱发凋亡样坏死,最终启动自噬,因而表达自噬标志物微管相关蛋白1轻链3-II(Microtubule-associated proteins1light chain3II, LC3-II)。泛素化RIP1是凋亡样坏死的关键分子,其特异性阻断剂necrostatin-1(nec-1)可以保护lecroptosis。在脑缺血再灌注和心肌缺血的细胞和动物模型都证实了necroptosis的存在,同时nec-1对这一特殊形式的坏死的逆转作用也得到验证。iecroptosis和nec-1的发现为细胞坏死的修复带来新的理论依据,为坏死的临床治疗提供了新的干预靶点。那么,在AKI的肾小管坏死是否存在可调控的坏死：necroptosis呢?目前尚未见相关报道。学者们在对AKI的发病机制进行研究的同时,在临床上也对AKI进行深入的探讨。为了使AKI的诊断规范化,肾脏病学专家,重症医学专家们先后公布了3个AKI的诊断标准：RIFLE (Risk、Injury, Failure, Loss, End stage renal disease)标准、AKIN(Acute kidney injury network)标准和新出台的KDIGO(Kidney Disease:Improving Global Outcomes)标准。JFLE标准、AKIN标准自出台后得到广泛的应用,据统计RIFLE标准的使用人次已达50,000余次,AKIN标准在重症患者,心脏术后的患者的应用也越来越普遍。自AKIN标准发布来,学者们对RIFLE标准和AKIN标准在AKI的诊断及分级上进行比较,但是何者更优,尚无定论。因此,为了建立统一的、规范的AKI诊断标准,改善全球肾脏病预后(KDIGO)工作组基于RIFLE标准和AKIN标准在2011年发布了AKI的KDIGO标准。但是KDIGO标准其具体的价值如何,较RIFLE标准和AKIN标准是否具有优势,目前尚无相关研究。第一章肾小管上皮细胞凋亡样坏死模型构建目的以体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)为靶细胞,构建肾小管上皮necroptosis体外模型。方法1.培养人肾小管上皮细胞HK-2细胞HK-2细胞在37℃的水浴复苏后,经1000rpm离心5mmin去除冻存液后,加入25cm2培养瓶,在37C,5%C02的条件下,用含10%FCS的DMEM/F12培养基培养细胞,待细胞生长至80%-90%融合时传代。2.不同处理下HK-2细胞形态学观察2.1根据参考文献采用TNF-a诱导凋亡,再采用zVAD-fink阻断凋亡,最后采用antimycinA耗竭ATP,以构建肾小管上皮细胞的体外模型。在相差显微镜下对37℃下不同处理的HK-2细胞直接拍片,观察其形态学差异。细胞分组：control; TNF-a+zVAD-fink+antimycinAlh; nec-1+control; nec-1+TNF-a+z VAD-fink+antimycinA1h。2.2电镜观察细胞的变化：细胞分组：control, TNF-a+zVAD-fink+antimycinAlh3.HK-2细胞活性检测3.1nec-1改善处理后细胞的活性重悬培养瓶中HK-2细胞,以8×103/nl接种于96孔培养板中,分为J2个实验组、1个阳性对照组和1个空白组,每组含4孔,继续培养12h后,各实验组按以下分组干预细胞：(1)正常对照组(control):不加任何干预因素的HK-2细胞(2)TNF-a组(10ng/ml)：采用10ng/ml的TNF-a孵育细胞6h(3)TNF-a+zVAD-fmk:采用10ng/ml的TNF-a和50umo1/1的zVAD-fink共孵育细胞6h(4)TNF-a+zVAD-fink+antimycinA30min:采用10ng/ml的TNF-a和50umol/l的zVAD-fink共孵育细胞6h后去除上清液采用antimycinA处理细胞30min(5)TNF-a+zVAD-fmk+antimycinA1h：采用10ng/ml的TNF-a和50umol/l的zVAD-fink共孵育细胞6h后去除上清液采用antimy cinA(10umo1/1)处理细胞1h(6)TNF-a+zVAD-fink+antimycinA2h:采用10ng/ml的TNF-a和50umol/I的zVAD-fink共孵育细胞6h后去除上清液采用antimycinA处理细胞2h(7)-(12)组：先给予20umol/1的nec-1预处理细胞8h后再给予其他处理,余处理方法同(1)-(6)。结束处理后去除上清液,加入100μl含有10%CCK-8的培养基后继续培养2h,最后用酶标仪在450nm波长下测每一孔的吸光度,按公式计算出各孔细胞存活率。(空白组则仅加CCK-8)4.目的蛋白LC3-Ⅱ的检测4.1采用western-blot检测不同处理后LC3-Ⅱ的表达,在6孔板中重复上述处理,分组同细胞活性检测中(1)-(6),余实验步骤按照说明书进行。4.2Western-blot分析采用nec-1预处理的细胞的LC3-Ⅱ的表达,顺序同细胞活性检测中(7)-(12),实验步骤同上。5.统计学分析计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)方法,方差齐性用LSD法进行组间多重比较,方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。P<0.05被定为有统计学差异。结果1.细胞形态学的变化：正常的细胞呈卵圆形和不规则形,铺路石状排列于培养瓶底,细胞中央有一卵圆形核,但是给予]TNF-a+zVAD-fink+antimycinA处理1小时后细胞及细胞器膨胀,而nec-1预处理组细胞的折光性较前增加；电镜下可见处理的细胞膜碎裂,线粒体变圆,肿胀,嵴逐渐模糊,胞浆中出现大量双层膜的自噬小体。2.nec-1特异性逆转HK-2细胞的活性：各实验组间HK-2肾小管上皮细胞存活率比,差异有统计学意义(F=410.780，P＝0.000)。在TNF-a+zVAD-fink+antimycinAl小时实验组,采用Nec-1预处理组,与未给予nec-1预处理相比,细胞的存活率增加了38.59%,有统计学差异(P<0.05)。但是在其他实验组,细胞的活性无明显改变。3.LC3-Ⅱ的表达量检测：各组间LC3-Ⅱ的表达量存在统计学差异(F=115.748,P<0.0001)。在TNF-a+zVAD-fm、TNF-a+zVAD-fink+antimycinA的3个时间梯度都发生LC3-Ⅱ的表达量增加(P<0.05),但是给予nec-1处理后只有TNF-a+zVAD-fmk+antimycinA1h组与未给予nec-1处理组细胞的LC3-Ⅱ的表达量明显下降(P<0.05)。结论1、体外研究证实在肾小管上皮细胞存在可调控的坏死：necroptosis。当发生necroptosis时,细胞的活性降低,细胞及其细胞器膨胀、溶解,表达自噬的标志物LC3-Ⅱ；2.necroptosis特异性的抑制剂nec-1能够增加necroptosis细胞的活性,逆转细胞坏死,降低自噬。第二章急性肾损伤临床诊断标准的比较目的本研究旨在比较AKI的KDIGO标准、AKIN标准、RIFLE在重症患者AKI诊断和预测预后价值的高低,以明确不同的AKI诊断标准的优劣。方法本研究回顾性收集广东省人民医院2009年10月-2010年7月ICU成人患者的病史资料建立数据库。排除标准如下：①慢性肾功能衰竭需要透析者；②在入住ICU前的一月间透析或入住ICU时就已透析者；③肾移植患者；④在入住ICU的48小时内未检测血清肌酐者。记录患者的年龄,性别,原发病,血清肌酐值,APACHE(?)评分,ICU住院时间及院内死亡等信息,并对患者长达1年的随访。急性肾损伤的定义以血清肌酐基础值和入住ICU后1周内的变化值为据,基础血肌酐值以入ICU前2天的血清肌酐的最低值或入住ICU后的第一次检测值为准。分别采用KDIGO标准、AKIN标准和RIFLE标准,对AKI进行诊断和分期,采用APACHE-(?)积分系统记录入住ICU24小时内的最差值,以评估患者病情的危重程度,以院内死亡和一年死亡作为观察终点。本研究通过分析KDIGO标准,AKIN标准,RIFLE标准诊断的AKI在重症患者的诊断及预测预后方面价值来评估KDIGO标准的敏感性及特异性。采用FridmanM检验分析3个标准比较KDIGO标准、AKIN标准和RIFLE标准在AKI诊断及对应的各期患者的院内死亡率及一年后的随访死亡率的价值,如存在差异则进一步采用配对X2检验进行两两比较,分析3个标准间的组间差异。采用1ogistic回归对3个标准诊断的AKI及分期发生院内死亡及一年后死亡的风险进行评估,并以年龄,性别,基线肌酐值进行校正；运用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve, ROC)曲线及曲线下面积评价RIFLE标准、AKIN标准和KDIGO标准用于预测急性肾损伤患者院内死亡和一年后随访死亡的价值。双侧P<0.05表明差异有统计学意义。结果①一般情况：共收集到524例患者的资料,其中男性356例(67.9%),女性158例(23.1%)；平均年龄56.54+16.79岁；基础血清肌酐值94.85±55.30(mmol/1),采用机械通气者156例(29.8%),平均ICU住院时间4(2,8),使用肾替代疗法的28例(5.3%)。②AKI诊断的比较：RIFLE标准诊断的AKI95例(18.1%)；AKIN标准诊断的AKI135(25.8%); KDIGO标准诊断的AKI140(26.7%)。AKIN标准、KDIGO标准诊断的AKI发生率分别高出RIFLE标准7.7%,8.6%,3个标准在AKI的诊断方面存在统计学差异(18.1%vs25.8%vs26.7%, X2=0.133,P=0.936);③AKI患者院内死亡率的分析：共64例(12.2%)患者发生院内死亡。RIFLE诊断的AKI死亡36个(34.1%)；AKIN诊断的AKI死亡46个(37.8%)；KDIGO诊断的AKI死亡47个(33.6%)。采用X2检验进行比较,发现3者诊断的AKI在预测院内死亡发生率方面没有统计学差异(34.1%vs33.6%vs37.8%,,X2=4.000, P=0.135)。采用logistic回归分析表明RIFLE、AKIN标准和KDIGO标准诊断的AKI患者均是院内死亡的危险因素,其优势比分别为9.194,95%CI(confidence interval)(5.018,16.845) vs12.006,95%CI (6.277,22.964) vs11.006,95%CI (5.78,20.956),(P<0.001)；并且AKI级别在很大程度决定了AKI患者死亡的风险。RIFLE分期标准预测患者院内死亡的ROC曲线下面积：0.732,95%CI(0.656,0.809)(P<0.001),AKIN分期预测患者院内死亡的ROC曲线下面积为0.780,95%CI:(0.713,0.846)(P<0.001), KDIGO分期预测患者院内死亡的ROC曲线下面积0.778,95%CI(0.710,0.844)(P<0.001),3者诊断的AKI在预测院内死亡价值相近。④一年后AKI患者的死亡率：一年后共随访患者422例,其中死亡90例(21.3%),RIFLE诊断的AKI死亡27例(50%),AKIN诊断的AKI死亡37例(44.05%),KDIGO诊断的AKI死亡38例(44.19%)。RIFLE、AKIN和KDIGO3个标准诊断的AKI均是一年死亡率的危险因素：OR(odds ratio)值分别为10.945,(95%CI：5.736,20.881)vs11.310,(95%CI:6.192,20.659)vs9.085,(95%CI:5.143,16.046),(P<0.001)。但是3者在预测AKI的一年死亡方面没有统计学差异：(50%vs44.05%vs44.19%,X2=3.000,P=0.223)。同时RIFLE、AKIN和KDIGO3个标准评估一年内死亡风险的ROC曲线下面积相近：0.611,(95%CI：0.600,0.693)vs0.644,(95%CI:0.596,0.689) vs0.648,(95%CI:0.600,0.693),(P=0.034)。结论我们的结果表明：在重症患者,KDIGO标准无论是在AKI的诊断还是在预测预后方面,较之前的RIFLE和AKIN标准都未能体现预期的优势。