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酿酒酵母中甘油代谢途径和乙醇代谢途径关系十分密切,甘油是乙醇合成过程中最主要的副产物之一。甘油代谢由GPD1基因和GPD2基因共同编码的3-磷酸甘油脱氢酶控制,沉默、干扰或剔除3-磷酸甘油脱氢酶基因能降低甘油的合成量,提高乙醇产量。酿酒酵母同源效率很高,外源序列只要有30～45bp的同源区域,就能够与其发生高效的重组。以PCR扩增方式为原理的LoxP-kanMX-LoxP与Cre/LoxP系统的敲除是研究酵母基因相关功能高效、准确的一种方法。5’UTR是真核生物中直接调控基因表达的关键因子,它的二级结构能阻碍基因翻译的过程、加速mRNA的降解。本研究根据质粒pUG6中LoxP-kanMX-LoxP基因序列和酿酒酵母GPD1基因的上下游非编码序列设计PCR扩增引物R1和R2。以pUG6质粒DNA为模板进行PCR反应得到GPD1基因敲除组件R1-R2。将敲除组件转入出发菌株Y01中,对GPD1基因敲除成功获得GPD1基因缺失的突变菌株GY01。生长和发酵结果表明,敲除重组菌株GY01在发酵48h时甘油含量下降幅度达到最大值18.25%。GY01菌株的最大乙醇积累量为17.81%(v/v),较出发菌提高了 14.23%。进一步利用5’UTR的反义RNA干扰技术对GPD2基因进行干扰沉默。首先构建酿酒酵母GPD2基因沉默表达载体pUPT-SGPD2,经限制性内切酶Kpn I线性化后转化至GPD1基因缺失菌株GY01,成功获得GPD2沉默菌株SGY01。发酵特性分析结果显示,GPD2基因沉默菌株SGY01相比GY01菌株甘油含量进一步下降了 4.18%,SGY01菌株乙醇最大积累量18.12%,较GY01菌株只提高了 0.31%。综上结果表明,建立在高效同源机制原理上的Cre/LoxP系统敲除技术是酿酒酵母育种工作的有效的方法,该技术突破了工业酿酒酵母没有选择标记基因的局限性。利用Cre/LoxP系统敲除掉GPD1基因可以降低酿酒酵母的甘油产量并提高产乙醇量;同时利用5’UTR反义RNA干扰技术能够有效抑制GPD2基因的表达,这些都为酿酒酵母基因工程育种奠定了理论基础。