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人骨保护素（human osteoprotegerin，hOPG）也称破骨细胞生成抑制因子（osteoclastgenesis inhibitory factor，OCIF），是由401个氨基酸组成的分泌型糖蛋白，包括一段由21个氨基酸组成的信号肽，其成熟肽由38D个氨基酸组成。NF-κB受体活化因子配基（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）是骨保护素的同源配基，又称为破骨细胞分化因子（osteoclast differentiation，factor，ODF），表达于成骨细胞／骨髓基质细胞表面，与位于破骨细胞或其前体表面的受体-核因子κB受体活化因子（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）结合后有力促进破骨细胞的发育和活化，引起骨吸收。OPG是RANKL的诱饵受体（decoy receptor），它与RANKL结合后，可以有效抑制由后者促进的破骨细胞分化、成熟和激活，阻止骨吸收。OPG／RANKL／RANK系统平衡失调对许多疾病所致的异常骨吸收起了重要的介导作用。OPG通过对RANKL的抑制，可能有效治疗骨质疏松，缓解骨痛，阻止骨量丢失和骨骼畸形，具有很好的临床开发价值。OPG N端D1～D4结构域仅由2个外显子编码，是OPG发挥生物学活性的主要结构区。本研究克隆表达了hOPG成熟肽N端片段及成熟肽全长。 本研究第一部分以人基因组DNA作为模板，PCR分别扩增hOPG基因外显子2和外显子3，利用外显子拼接法得到hOPG N端D1～D4域编码序列。并将其分别克隆入表达载体pET42a和pQE30，在原核表达系统对hOPG N端片段进行表达研究。（1）使用表达载体pET42a：采用重叠延伸PCR法扩增hOPG N端（D1～D4区）序列与载体pET42a嵌合分子，重建了pET42a序列中多克隆位点（MCS）中第一个位点PshAⅠ编码氨基酸被Xa裂解位点至MCS前大约40个碱基BglⅡ位点之间的序列，将此嵌合分子从Bgl Ⅱ和Sal Ⅰ位点克隆入pET42a。重组表达载体j毛创卡盆料大侧卜们件月卜举位论文pET42a-hOPG转化到大肠杆菌BLZI（D E3）中诱导表达。SDS一PAGE表明产物主要以包涵体形式存在，可被抗OPG多克隆抗体识别。经条件优化后，融合蛋白GST-hOPG(D1川产量约占菌体总蛋白的20%。包涵体经溶解、复性、Glutathione sePharose 4B亲和层析纯化后，在Xa因子作用下，产生重组h0PGN端蛋白，通过进一步分离纯化得到该蛋白的初级产品。粗略测定纯化后产量为34mg生培养基。（2）使用表达载体pQE30:再次采用重叠延伸PeR法使该hoPGN端01一D4域编码序列与载体pQE3O 6XHis前部分序列相连，并增加2个His密码子序列，然后克隆入载体pQE30，重组表达载体pQE30一hOPG转化到大肠杆菌M15[P REP4]中诱导表达。SDS一PAGE表明sxHIS产物主以包涵体形式存在，可被抗OPG多克隆抗体识别。经条件优化后，融合蛋白8、His一hOPG(Dl一产量约占菌体总蛋白的15.6%，在变性条件下通过Ni一NTA金属鳌合亲和层析柱对表达产物进行纯化后再经梯度透析进行复性，得到该融合蛋白的初级产品，产量约为3omg/L培养基。采用破骨细胞样细胞（Osteoelast Like Cell，OLC）诱导分化实验来检测重组蛋白的生物活性，证实这两种重组蛋白可以抑制OLC的生成。 本研究第二部分还完成了人骨保护素（h0PG）成熟蛋白基因在毕赤酵母中的表达及免疫学鉴定。首先利用RT-PCR法从人成骨细胞得到hOPG成熟肤。DNA全长序列，为使未来分泌表达产物具有完全正确的N末端（不含由载体编码的任何多余氨基酸），再采用重叠延伸PCR策略，将毕赤酵母表达载体pPICgK信号肚裂解位点前含有单一限制酶位点BamHI的一段序列与h0PG成熟肤。DNA全长序列拼接在一起，从刀以用Hl和Ec口Rl位点插入pPICgK，在真核表达系统对h0PG成熟肤全长进行表达研究。重组分泌型表达载体pPICgK一hOPG转化入酵母细胞GSll5，先通过MD、MM平板筛选出His+Mut+表型，再以G418筛选出多拷贝转化子。甲醇诱导表达后培养基上清表达产物经Westem blot分析，分子量约为52kD的蛋j毛，卜医冲略大拳徽卜d卜拳位论文白条带可被OPG抗体识别，显示表达产物具有良好的抗原性。 本研究成功地表达了人OPG成熟肤N端片段及成熟肤全长，这对于进一步研究OPG/RANKL/RANK系统的生物学功能，开发重组OPG蛋白作为骨吸收异常骨病的治疗药物具有重要价值。