苯(benzene,BZ)是一种低分子量的碳氢化合物，随着工业发展和人们生活水平的提高，苯污染形势日趋严峻。人们在工业生产和日常生活中都可能接触苯。苯可通过呼吸道、消化道和皮肤进入机体，进入人体的苯在肝脏中被CYP2E1氧化为具有毒性的代谢产物。不断积累的资料显示，苯可引起造血系统多种功能障碍，包括所有类型的白血病、淋巴瘤、骨髓增生和再生障碍性贫血，国际癌症研究所(IARC)将其定为Ⅰ类致癌物，而苯导致中毒的机制目前仍不完全清楚，对苯及其代谢产物对造血系统毒作用机制的研究仍是今后重要的研究方向，而信号转导通路异常与肿瘤的发生、发展关系密切，因此在苯致白血病机制研究领域中，发现异常的细胞信号转导通路是其中的研究热点之一。 在许多肿瘤如白血病、乳腺癌、结肠癌和卵巢癌中发现磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/Serine-threonine kinase，PI3K/Akt)信号转导通路的激活，AKt在细胞内信号转导系统中位于PI3K的下游，主要通过PI3K激活，该通路的活化导致肿瘤细胞增殖过度、凋亡受抑。 PI3K/Akt信号转导通路可以调节许多信号分子，同时，其本身也受信号分子的调控。其中，最可能的调控分子是活性氧(reactive oxygen species，ROS)。在白血病中过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH·)是ROS的主要型式。研究表明在BZ及其代谢物引起的细胞毒性和致癌性中，氧化损伤起重要作用。 鉴于在白血病中存在氧化损伤和PI3K/Akt信号转导通路的异常激活，并且两者可能存在调控与被调控关系，我们设想苯可能通过诱导ROS的产生激活PI3K/Akt信号转导通路，导致对血液系统的损伤。为验证这个设想，本课题选择苯代谢产物中的1，4-苯醌作为受试物，采用急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞作为实验对象。 本课题研究目的是：观察苯醌导致的氧化应激与PI3K/Akt信号转导通路在HL-60细胞增殖中的作用，进而了解ROS与PI3K/Akt信号转导通路在苯致白血病中的作用，为预防和治疗苯导致的血液中毒提供新的依据。 研究方法： 1.观察细胞生长状态，检测细胞存活率 用BQ/PBS对HL-60细胞进行染毒处理，设空白对照、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L六个剂量组。染毒2h后，重新接种于新的培养基中，孵育18h后，收获细胞，并观察细胞形态，台盼蓝拒染法观察细胞存活水平。 2.检测细胞增殖率 用BQ/PBS对HL-60细胞进行染毒处理，设空白对照、1 μmol/L、3μmol/L、5μmol/L四个剂量组。染毒2h后，然后重新接种于含3％血清的培养基中，孵育18h后，收获细胞，alamar blue法检测细胞增殖率。 3.过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)和PI3K抑制剂(LY294002)预处理对HL-60细胞增殖的影响 HL-60细胞设对照组、3μmol/L，BQ染毒组、CAT+3μmol/L BQ染毒组、LY294002+3μmol/L BQ染毒组四组。染毒2h后，然后重新接种于含3％血清的培养基中，孵育18h后，收获细胞，alamar blue法检测细胞增殖率。 4.过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)和PI3K抑制剂(LY294002)预处理对HL-60细胞产成ROS的影响 HL-60细胞设对照组、3μmol/L BQ染毒组、CAT+3μmol/L BQ染毒组、LY294002+3μmol/L BQ染毒组四组。染毒2h后，收获细胞。DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS。 5.苯醌染毒及过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)、PI3K抑制剂(LY294002)预处理对HL-60细胞内p-Akt和Akt表达的影响 HL-60细胞设对照组、3μmol/L BQ染毒组、CAT+3μmol/L BQ染毒组、LY294002+3μmol/L BQ染毒组四组。染毒5min后，收获细胞。Western blot方法检测各组HL-60细胞内p-Akt和Akt表达的影响。 6.细胞周期观察 HL-60细胞设对照组、3μmol/L BQ染毒组、CAT+3μmol/L BQ染毒组、LY294002+3μmol/L BQ染毒组四组。染毒2h后，然后重新接种于含3％血清的培养基中，孵育18h后，收获细胞，用PI染液处理细胞，即可进行流式细胞仪分析。 7.统计学分析 每个样品均设3个平行样，采用SPSS 13.0统计软件建立实验结果数据库，以((-x)±s)表示定量指标的平均值，根据资料特征采用x2检验、t检验进行数据分析。 研究结果： 1.对细胞状态的观察，对细胞存活率的检测 低浓度剂量苯醌(≤5μmol/L)作用于HL-60细胞后，光镜下可见细胞外形规则，活细胞数明显较空白对照组多；中等浓度剂量苯醌(10μmol/L)作用于HL-60细胞后，可见有少许变形细胞；高浓度剂量苯醌(≥10μmol/L)作用于HL-60细胞后，细胞大量死亡。台盼蓝染色后，染毒浓度低于5μmol/L的剂量组，细胞存活率与对照组相比无明显降低，而高于10μmol/L的剂量组，细胞存活率与对照组相比则明显降低。 2.确定苯醌最终染毒剂量 根据alamar blue染色结果，本实验确定了能够引起HL-60细胞增殖最明显的苯醌染毒剂量3μmol/L。 3.过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)和PI3K抑制剂(LY294002)预处理对HL-60细胞增殖的影响 CAT+BQ染毒组与LY294002+BQ染毒组细胞增殖情况均低于BQ染毒组。 4.过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)和PI3K抑制剂(LY294002)预处理对HL-60细胞产成ROS的影响 BQ染毒组细胞内产生的ROS量比对照组多； CAT+BQ染毒组细胞内产生的ROS量比BQ染毒组低； LY294002+BQ染毒组细胞内产生的ROS量与BQ染毒组相比没有差别。 5.苯醌染毒及过氧化氢清除剂(过氧化氢酶)、PI3K抑制剂(LY294002)预处理对HL-60细胞内p-Akt和Akt表达的影响 BQ染毒组HL-60细胞p-Akt蛋白表达量与对照组相比明显增加；CAT+BQ染毒组HL-60细胞p-Akt蛋白表达量约是BQ染毒组的三分之一；LY294002+BQ染毒组HL-60细胞p-Akt蛋白表达量也约是BQ染毒组的三分之一。对照组、BQ染毒组、CAT+BQ染毒组和LY294002+BQ染毒组细胞内Akt表达水平无明显差别。 6.细胞周期观察 BQ染毒组进入S、G2期HL-60细胞比例均比对照组高，而进入G1期的细胞比例则比对照组低；CAT+BQ染毒组和LY294002+BQ染毒组分别与BQ染毒组相比，二者进入S、G2期HL-60细胞比例均比BQ染毒组低，而进入G1期的细胞比例均比BQ染毒组高。 结论： 1.本实验用苯醌对急性粒细胞白血病细胞HL-60进行染毒，建立促进该细胞增殖的方法，模拟了白血病骨髓内粒细胞的异常增长。 2.在苯醌促HL-60细胞增殖过程中，ROS与PI3K/Akt起着重要的作用，并证明了苯醌染毒后产生的氧化应激激活了PI3K/Akt通路从而导致HL-60细胞的增殖，也就是说，在接触苯的过程中，产生的ROS通过激活PI3K/Akt通路，引起细胞代谢改变，这是苯致白血病过程中重要的信号通路之一，也是引起细胞周期发生改变的原因之一。