研究背景:子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤,是世界各地妇女癌症致死的重要原因,为女性生殖道三大恶性肿瘤之一,占女性生殖道恶性肿瘤的20%-30%。近期研究显示,子宫内膜癌的发病率不断上升,且有明显的年轻化趋势。尽管目前对子宫内膜癌经过规范化治疗后,5年生存率有所提升,但对晚期、低分化子宫内膜癌或复发型子宫内膜癌的治疗效果仍不显著。因此,探究子宫内膜癌的发生和进展的细胞及分子机制,新的诊断和预后标记物以及子宫内膜癌新的治疗策略对于改善子宫内膜癌患者的临床诊断及预后具有迫切而现实的意义。目前大量研究表明,子宫内膜癌与肥胖、糖尿病、高血压或者是长期暴露于无抵抗的雌激素等因素有关,但是子宫内膜癌发生和发展的具体机制仍不明确,基因调控异常如基因表观遗传等不足以完全解释子宫内膜癌的发生发展。因此,寻找新的可替代的靶向策略,对于子宫内膜癌的诊断、病人的治疗及预后的预测是迫在眉睫的。近年来研究发现,micro RNA(miRNA)在包括子宫内膜癌等多种癌症的分子生物进程中起到至关重要的作用。成熟微小RNA(micro RNA,简写为miRNA,miR)是近些年研究的热点,是一类由大约19-25个核苷酸组成的非编码单链小分子RNA,能够通过碱基互补配对的方式与特异的靶基因m RNA的3,UTR结合,进而抑制靶基因的翻译或直接降解miRNA,在转录后水平调节靶基因的表达。自1993年Lee等在秀丽线虫中发现首个miRNA:lin-4以来,miRNAs日渐成为肿瘤学领域研究的热点之一,在很多恶性肿瘤例如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌及肺癌等中异常表达的miRNA发挥着促癌或抑癌作用。同样,miRNAs在子宫内膜癌进展的过程中扮演着促癌或抑癌的双重角色,参与到子宫内膜癌发生和进展的各个时期。例如,miRNA-200家族和miR-205等发挥着促进肿瘤发生发展的功能,即为onco-miRNAs;miR-424,miR-223和miRNA-124等在子宫内膜癌中担当抑癌基因的角色,即为tumor-suppressing miRNAs。由此可见进一步探索与子宫内膜癌相关的特异性miRNAs及其靶基因的功能及作用机制,有助于明确子宫内膜癌的发生发展机制,为子宫内膜癌的治疗和预后提供新思路。首次在人Hela细胞中发现的miR-29家族,包括miR-29a、miR-29b和miR-29c,是miRNAs大家族中的一员,miR-29家族均在多种肿瘤中发挥抑癌基因的角色,其中最为重要的成员是miR-29b,有研究表明miR-29b参与了肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡和转移等过程,其表达异常能导致细胞功能异常。miR-29b在许多肿瘤中表达异常,如乳腺癌、肝癌和前列腺癌等。miR-29b已成为与肿瘤诊断、治疗和预后相关的具有潜在价值的肿瘤标志物。然而,有关于miR-29b在子宫内膜癌中的表达、与临床病理特征的相关性及其在子宫内膜癌血管新生中的作用,尚未见相关研究报道。肿瘤血管生成是指由原有血管形成的新型血管,其在肿瘤生长或转移中起主要作用。肿瘤的生长具有血管生成依赖性,并在此过程中产生多种促血管内皮生长因子。其中血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)是参与内皮细胞增殖,分化和迁移的促血管生成因子之一。我们知道,促分裂原活化的蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路是将胞外信号传递到细胞核内最重要的信号通路,在调控细胞增殖分化、血管生成和代谢等功能中起有关键的作用。在子宫中,已有报道说明雌激素可以快速激活各种信号途径,包括MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路。因此,在子宫内膜癌的血管生成中是否需要MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路的参与尚不清楚。基于此,我们利用实时荧光定量PCR检测miR-29b在子宫内膜癌组织及细胞株中的表达,进一步分析其与子宫内膜癌血管生成的关系,并探究其可能的调控机制,为进一步寻找新的子宫内膜癌的发病机制和治疗靶点奠定理论基础。方法:一、miR-29b在子宫内膜癌组织及细胞中的表达及其临床意义选择2013年2月至2015年4月南昌大学第一附属医院收治的子宫内膜癌患者,经手术治疗后取子宫内膜癌组织及癌旁正常组织,快速置于液氮中保存,另取部分组织标本用福尔马林固定,石蜡包埋。q RT-PCR检测癌组织、癌旁组织以及子宫内膜癌细胞株Ⅰ型子宫内膜癌细胞系RL-95-2和Ⅱ型子宫内膜癌细胞系HEC-1-B中miR-29b的表达水平;采用统计分析法对子宫内膜癌组织中miR-29b的表达水平与患者临床病理特征的关系。采用CD34抗体标记血管内皮细胞,以呈棕黄色的单内皮细胞或内皮细胞串计为一个血管,免疫组化检测子宫内膜癌组织及其癌旁组织中CD34的表达,判定其血管新生水平并分析其与miR-29b表达的相关性。二、miR-29b调控子宫内膜癌血管新生的作用和机制研究我们通过生物信息学软件预测miR-29b与VEGFA的靶向关系,并通过q RT-PCR、Western blot及双荧光素酶报告基因系统验证;q RT-PCR检测癌组织、癌旁组织中VEGFA的表达,分析子宫内膜癌组织中VEGFA m RNA水平与患者临床病理特征的关系;接着,我们将RL-95-2细胞分为八组:正常对照组(Normal组):人子宫内膜上皮细胞;空白对照组(Blank组,无转染质粒);p MIR-control组:(转染空载质粒);p MIR-miR-29b组:(转染miR-29b重组质粒);LNA-control组:(转染寡核苷酸对照物);LNA-miR-29b inhibitor组:(转染miRCURY LNA?miR-29b inhibitor);LNA-miR-29b inhibitor+PD98059组:(转染miRCURY LNA?miR-29b inhibitor后添加MAPK/ERK信号通路抑制剂PD98059);LNA-miR-29b inhibitor+wortmanin组:(转染miRCURY LNA?miR-29b inhibitor后添加PI3K/Akt信号通路抑制剂wortmanin)。q RT-PCR和Western blot检测各组细胞中miR-29b、VEGFA、MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路下游靶蛋白ERK、Akt、m TOR、Bcl-2的表达;继而将各组细胞移植裸鼠,建立子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,免疫组化法检测裸鼠肿瘤生长的微血管密度。结果:一、miR-29b在子宫内膜癌组织及细胞中的表达及其临床意义1、与癌旁组织相比,癌组织的miR-29b的表达水平降低(P<0.05),与人子宫内膜细胞相比,癌细胞的miR-29b表达水平降低(P<0.05)。2、子宫内膜癌患者中Ⅰ+Ⅱ期的miRNA-29b表达水平高于Ⅲ+Ⅳ期,有淋巴结转移者的miRNA-29b表达水平低于无淋巴结转移者,差异有统计学意义(均P<0.01)3、与癌旁组织相比,癌组织的中的微血管密度明显增高(P<0.05),并与miR-29b的表达水平呈负相关关系(Pearson r=0.751,P<0.01;Spearmanrho = 0.772,P < 0.01)。二、miR-29b调控子宫内膜癌血管新生的作用和机制研究1、VEGFA基因是miR-29b的直接靶基因。2、子宫内膜癌患者中Ⅰ+Ⅱ期VEGFA m RNA的表达水平低于Ⅲ+Ⅳ期;有淋巴结转移者的VEGFA m RNA的表达水平高于无淋巴结转移者,差异有统计学意义(均P<0.01);3、与Normal组相比,各组癌细胞中miR-29b水平明显下降,VEGFA、ERK、Akt、m TOR、Bcl-2的m RNA和蛋白表达水平升高(均P<0.05)。与Blank组相比,miR-29b组细胞的miR-29b上升,VEGFA及下游靶蛋白的m RNA和蛋白表达水平降低(均P<0.05);LNA-miR-29b inhibitor组细胞的miR-29b下降,VEGFA及下游靶蛋白的m RNA和蛋白表达水平上升(均P<0.05),添加MAPK/ERK或PI3K/Akt信号通路抑制剂后,能在一定程度上缓解这种趋势;4、在裸鼠移植瘤模型中,与Blank组裸鼠相比,miR-29b组裸鼠的皮下肿瘤体积和重量、微血管密度显著减少,LNA-miR-29b inhibitor组裸鼠的皮下肿瘤体积和重量、微血管密度显著增加(均P<0.05);而LNA-miR-29b inhibitor+PD98059组、LNA-miR-29b inhibitor+wortmanin组裸鼠中能在一定程度上缓解这种趋势。结论:我们的研究表明在子宫内膜癌中miR-29b可以直接靶向抑制VEGFA基因,下调MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路,从而抑制子宫内膜癌血管新生,揭示了miR-29b在子宫内膜癌发生发展中的部分作用和分子机制,为临床治疗子宫内膜癌提供了新的靶点。