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目的：
口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)好发于头颈部，是较常见的恶性肿瘤。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis)在口腔微生物群中作用关键，能够促进形成有利于OSCC发生发展的肿瘤微环境(Tumor micro-environment，TME)。目前，大量研究表明在OSCC的TME中，P.gingivalis对促进肿瘤细胞增殖分化和侵袭转移等过程中扮演重要角色，本研究旨在探讨P.gingivalis在OSCC的TME中通过活化CXCL2/CXCR2轴促进OSCC进展相关机制。
方法：
第一部分，1.回顾性研究新疆医科大学附属口腔医院颌面肿瘤外科收治的OSCC患者的病例及组织标本，严格随访，共计205例。按照赫尔辛基宣言关于人类组织标本的使用条例进行免疫组织化学染色。经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，患者完全知情同意并签署知情同意书后实施。收集20例OSCC患者的手术组织标本(所有患者术前均未接受放化疗)，并留取相应非肿瘤口腔组织标本(设定为对照组)，利用免疫组织化学技术检测OSCC患者组织标本中P.gingivalis的表达水平并比较其与非肿瘤口腔组织标本表达水平的差异。2.利用生物信息学分析，通过GEO数据库下载GSE87539和GSE138206表达谱基因数据库，根据平台注释信息将探针转化为相应的基因符号。GSE87539数据集共包含6组样本，实验组为P.gingivalis感染正常牙龈上皮细胞样本；对照组为单独正常牙龈上皮细胞样本，每组3个样，共6个样本。GSE138206数据集共包含12组样本，实验组为OSCC组织样本；对照组为正常口腔组织样本，每组6个样，共12个样本。免疫组织化学分别检测OSCC患者组织标本中CXCL2和TANs的表达水平，组间比较采用t检验和方差分析，相关性分析采用Pearson相关性分析。分析三者表达水平与临床指标之间的相关性以及对预后的影响。3.明确OSCC组织中P.gingivalis、CXCL2和TANs的免疫表达位置关系。第二部分，1.体外培养TSCCA口腔鳞癌细胞株及P.gingivalis菌株(ATCC33277)，OSCC患者外周血分离TANs，以MOI=50(细菌/细胞)建立共培养模型，在共培养模型基础上构建TME细胞模型。2.利用Elisa检测TSCCA、TSCCA+TANs、TSCCA+P.gingivalis和TSCCA+P.gingivalis+TANs各组上清液中CXCL2的含量。3.通过趋化实验检测TSCCA、P.gingivalis和TSCCA+P.gingivalis各组上清液对TANs趋化能力的差异。4.检测TSCCA、TSCCA+P.gingivalis、TSCCA+TANs和TSCCA+P.gingivalis+TANs各组中TSCCA细胞生物学行为的变化。5.加入CXCL2/CXCR2信号轴抑制剂SCH527123，比较TSCCA+P.gingivalis+TANs+SCH527123组与TSCCA+P.gingivalis+TANs组中TSCCA高侵袭的细胞生物学行为能力是否回复。6.体外培养SCC7鼠源性鳞癌细胞株，建立共培养模型，使用C57BL/6小鼠建立肿瘤动物模型，使用不同浓度SCH527123进行干预，将实验分为：对照组(SCC7)、低剂量干预组(SCC7+P.gingivalis+0.05nMSCH527123)、高剂量干预组(SCC7+P.gingivalis+0.20nMSCH527123)和实验组(SCC7+P.gingivalis)，并通过体积计算、免疫组化和免疫荧光检测小鼠肿瘤模型的变化。第三部分，1.利用qRT-PCR和WesternBlot分别在mRNA和蛋白水平检测在TME细胞模型中，EMT表型获取及所调控通路。2.构建CXCL2和CXCR2的shRNA慢病毒载体，转染至共培养模型，检测敲低效率。3.使用阳性细胞株构建共培养模型和TME细胞模型，检测TME细胞模型中EMT表型及所调控通路的改变。
结果：
第一部分，1.共205例OSCC患者，P.gingivalis免疫表达呈弱阳性的有86例，119例P.gingivalis免疫表达呈强阳性，而在非肿瘤组织中呈阴性表达。2.对数据集进行标准化处理后，GSE87539数据集中共识别26469个差异基因，GSE138206中识别9443个差异基因，其中有89个基因重叠，CXCL2位于hub基因中，并且表达明显上调。第二部分，1.通过16SrRNA测序技术对P.gingivalis菌液进行测序分析，将测序结果于pubmed数据库进行比对，结果证实与标准菌株ATCC33277符合率达99.3%，利用激光共聚焦、qRT-PCR和WesternBlot验证共培养模型的成功建立。2.Elisa验证TSCCA+P.gingivalis+TANs上清液组中CXCL2的含量显著高于TSCCA、TSCCA+P.gingivalis和TSCCA+TANs上清液组(P＜0.001)。3.细胞趋化实验验证TSCCA+P.gingivalis上清液组对TANs的趋化能力显著高于TSCCA和P.gingivalis上清液组(P＜0.001)。4.CCK8法增殖实验、细胞划痕实验和细胞侵袭实验分别验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于TSCCA、TSCCA+P.gingivalis和TSCCA+TANs组(P＜0.001)。5.加入CXCL2/CXCR2信号轴抑制剂SCH527123后，TSCCA+P.gingivalis+TANs+SCH527123组细胞的增殖、迁移和侵袭表型与TSCCA+P.gingivalis+TANs组比较显著降低(P＜0.001)。6.通过肿瘤动物模型验证P.gingivalis能够促进小鼠肿瘤增长，使用SCH527123干预后能够有效显著抑制肿瘤增长且高剂量组更为显著。第三部分，1.利用qRT-PCR验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组中CXCL2(P＜0.001)、CXCR2(P＜0.001)、JAK1(P＜0.05)、STAT3(P＜0.001)和N-cadherin(P＜0.01)的mRNA表达水平较TSCCA组显著升高，而E-cadherin(P＜0.01)的mRNA表达水平显著降低。利用WesternBlot验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组中CXCL2(P＜0.001)、CXCR2(P＜0.001)、JAK1(P＜0.05)、STAT3(P＜0.001)、p-JAK1(P＜0.001)、p-STAT3(P＜0.001)和N-cadherin(P＜0.001)的蛋白表达水平较TSCCA组显著升高，而E-cadherin(P＜0.001)的蛋白表达水平显著降低。2.构建CXCL2-shRNA和CXCR2-shRNA慢病毒载体，转染至共培养模型后验证敲低效率。3.利用流式细胞仪成功筛选出CXCL2/CXCR2-shRNA共染TSCCA细胞株，通过有限稀释法成功挑取阳性克隆细胞。4.使用阳性克隆细胞进行细胞模型的建立，利用qRT-PCR验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组与TSCCA组比较，JAK1的mRNA表达水平出现了降低(P＜0.05)，而STAT3(P＞0.05)、N-cadherin(P＞0.05)和E-cadherin(P＞0.05)的mRNA表达水平较TSCCA组之间比较差异不显著。利用WesternBlot验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组与TSCCA组比较，除了N-cadherin的蛋白表达水平升高(P＜0.01)外，JAK1(P＞0.05)、STAT3(P＞0.05)、p-JAK1(P＞0.05)、p-STAT3(＞0.05)、E-cadherin(P＞0.05)的蛋白表达水平无统计学差异。同时将感染慢病毒的TSCCA+P.gingivalis+TANs组与未感染慢病毒的TSCCA+P.gingivalis+TANs组进行比较，在mRNA和蛋白水平均发现JAK1/STAT3信号通路的活化程度显著降低且EMT表现出现明显的回复。
结论：
1.P.gingivalis、CXCL2和TANs在OSCC组织中的表达水平较非肿瘤组织显著升高，三者高表达与OSCC患者的不良预后相关。2.TSCCA+P.gingivalis+TANs上清液组中CXCL2含量显著升高，TSCCA+P.gingivalis上清液组对TANs的趋化能力最强。3.TSCCA+P.gingivalis+TANs组中细胞的增殖、迁移和侵袭能力最强，CXCL2/CXCR2信号轴抑制剂能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。4.动物模型验证P.gingivalis能够促进小鼠肿瘤增长，使用SCH527123干预后能够显著抑制肿瘤增长。5.TSCCA+P.gingivalis+TANs组能够通过活化CXCL2/CXCR2信号轴来激活JAK1/STAT3信号通路，使肿瘤出现EMT表型，敲低CXCL2/CXCR2信号轴能够显著降低JAK1/STAT3信号通路活化程度和逆转EMT表型。
口腔鳞状细胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)好发于头颈部，是较常见的恶性肿瘤。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis)在口腔微生物群中作用关键，能够促进形成有利于OSCC发生发展的肿瘤微环境(Tumor micro-environment，TME)。目前，大量研究表明在OSCC的TME中，P.gingivalis对促进肿瘤细胞增殖分化和侵袭转移等过程中扮演重要角色，本研究旨在探讨P.gingivalis在OSCC的TME中通过活化CXCL2/CXCR2轴促进OSCC进展相关机制。
方法：
第一部分，1.回顾性研究新疆医科大学附属口腔医院颌面肿瘤外科收治的OSCC患者的病例及组织标本，严格随访，共计205例。按照赫尔辛基宣言关于人类组织标本的使用条例进行免疫组织化学染色。经新疆医科大学第一附属医院伦理委员会批准，患者完全知情同意并签署知情同意书后实施。收集20例OSCC患者的手术组织标本(所有患者术前均未接受放化疗)，并留取相应非肿瘤口腔组织标本(设定为对照组)，利用免疫组织化学技术检测OSCC患者组织标本中P.gingivalis的表达水平并比较其与非肿瘤口腔组织标本表达水平的差异。2.利用生物信息学分析，通过GEO数据库下载GSE87539和GSE138206表达谱基因数据库，根据平台注释信息将探针转化为相应的基因符号。GSE87539数据集共包含6组样本，实验组为P.gingivalis感染正常牙龈上皮细胞样本；对照组为单独正常牙龈上皮细胞样本，每组3个样，共6个样本。GSE138206数据集共包含12组样本，实验组为OSCC组织样本；对照组为正常口腔组织样本，每组6个样，共12个样本。免疫组织化学分别检测OSCC患者组织标本中CXCL2和TANs的表达水平，组间比较采用t检验和方差分析，相关性分析采用Pearson相关性分析。分析三者表达水平与临床指标之间的相关性以及对预后的影响。3.明确OSCC组织中P.gingivalis、CXCL2和TANs的免疫表达位置关系。第二部分，1.体外培养TSCCA口腔鳞癌细胞株及P.gingivalis菌株(ATCC33277)，OSCC患者外周血分离TANs，以MOI=50(细菌/细胞)建立共培养模型，在共培养模型基础上构建TME细胞模型。2.利用Elisa检测TSCCA、TSCCA+TANs、TSCCA+P.gingivalis和TSCCA+P.gingivalis+TANs各组上清液中CXCL2的含量。3.通过趋化实验检测TSCCA、P.gingivalis和TSCCA+P.gingivalis各组上清液对TANs趋化能力的差异。4.检测TSCCA、TSCCA+P.gingivalis、TSCCA+TANs和TSCCA+P.gingivalis+TANs各组中TSCCA细胞生物学行为的变化。5.加入CXCL2/CXCR2信号轴抑制剂SCH527123，比较TSCCA+P.gingivalis+TANs+SCH527123组与TSCCA+P.gingivalis+TANs组中TSCCA高侵袭的细胞生物学行为能力是否回复。6.体外培养SCC7鼠源性鳞癌细胞株，建立共培养模型，使用C57BL/6小鼠建立肿瘤动物模型，使用不同浓度SCH527123进行干预，将实验分为：对照组(SCC7)、低剂量干预组(SCC7+P.gingivalis+0.05nMSCH527123)、高剂量干预组(SCC7+P.gingivalis+0.20nMSCH527123)和实验组(SCC7+P.gingivalis)，并通过体积计算、免疫组化和免疫荧光检测小鼠肿瘤模型的变化。第三部分，1.利用qRT-PCR和WesternBlot分别在mRNA和蛋白水平检测在TME细胞模型中，EMT表型获取及所调控通路。2.构建CXCL2和CXCR2的shRNA慢病毒载体，转染至共培养模型，检测敲低效率。3.使用阳性细胞株构建共培养模型和TME细胞模型，检测TME细胞模型中EMT表型及所调控通路的改变。
结果：
第一部分，1.共205例OSCC患者，P.gingivalis免疫表达呈弱阳性的有86例，119例P.gingivalis免疫表达呈强阳性，而在非肿瘤组织中呈阴性表达。2.对数据集进行标准化处理后，GSE87539数据集中共识别26469个差异基因，GSE138206中识别9443个差异基因，其中有89个基因重叠，CXCL2位于hub基因中，并且表达明显上调。第二部分，1.通过16SrRNA测序技术对P.gingivalis菌液进行测序分析，将测序结果于pubmed数据库进行比对，结果证实与标准菌株ATCC33277符合率达99.3%，利用激光共聚焦、qRT-PCR和WesternBlot验证共培养模型的成功建立。2.Elisa验证TSCCA+P.gingivalis+TANs上清液组中CXCL2的含量显著高于TSCCA、TSCCA+P.gingivalis和TSCCA+TANs上清液组(P＜0.001)。3.细胞趋化实验验证TSCCA+P.gingivalis上清液组对TANs的趋化能力显著高于TSCCA和P.gingivalis上清液组(P＜0.001)。4.CCK8法增殖实验、细胞划痕实验和细胞侵袭实验分别验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著高于TSCCA、TSCCA+P.gingivalis和TSCCA+TANs组(P＜0.001)。5.加入CXCL2/CXCR2信号轴抑制剂SCH527123后，TSCCA+P.gingivalis+TANs+SCH527123组细胞的增殖、迁移和侵袭表型与TSCCA+P.gingivalis+TANs组比较显著降低(P＜0.001)。6.通过肿瘤动物模型验证P.gingivalis能够促进小鼠肿瘤增长，使用SCH527123干预后能够有效显著抑制肿瘤增长且高剂量组更为显著。第三部分，1.利用qRT-PCR验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组中CXCL2(P＜0.001)、CXCR2(P＜0.001)、JAK1(P＜0.05)、STAT3(P＜0.001)和N-cadherin(P＜0.01)的mRNA表达水平较TSCCA组显著升高，而E-cadherin(P＜0.01)的mRNA表达水平显著降低。利用WesternBlot验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组中CXCL2(P＜0.001)、CXCR2(P＜0.001)、JAK1(P＜0.05)、STAT3(P＜0.001)、p-JAK1(P＜0.001)、p-STAT3(P＜0.001)和N-cadherin(P＜0.001)的蛋白表达水平较TSCCA组显著升高，而E-cadherin(P＜0.001)的蛋白表达水平显著降低。2.构建CXCL2-shRNA和CXCR2-shRNA慢病毒载体，转染至共培养模型后验证敲低效率。3.利用流式细胞仪成功筛选出CXCL2/CXCR2-shRNA共染TSCCA细胞株，通过有限稀释法成功挑取阳性克隆细胞。4.使用阳性克隆细胞进行细胞模型的建立，利用qRT-PCR验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组与TSCCA组比较，JAK1的mRNA表达水平出现了降低(P＜0.05)，而STAT3(P＞0.05)、N-cadherin(P＞0.05)和E-cadherin(P＞0.05)的mRNA表达水平较TSCCA组之间比较差异不显著。利用WesternBlot验证TSCCA+P.gingivalis+TANs组与TSCCA组比较，除了N-cadherin的蛋白表达水平升高(P＜0.01)外，JAK1(P＞0.05)、STAT3(P＞0.05)、p-JAK1(P＞0.05)、p-STAT3(＞0.05)、E-cadherin(P＞0.05)的蛋白表达水平无统计学差异。同时将感染慢病毒的TSCCA+P.gingivalis+TANs组与未感染慢病毒的TSCCA+P.gingivalis+TANs组进行比较，在mRNA和蛋白水平均发现JAK1/STAT3信号通路的活化程度显著降低且EMT表现出现明显的回复。
结论：
1.P.gingivalis、CXCL2和TANs在OSCC组织中的表达水平较非肿瘤组织显著升高，三者高表达与OSCC患者的不良预后相关。2.TSCCA+P.gingivalis+TANs上清液组中CXCL2含量显著升高，TSCCA+P.gingivalis上清液组对TANs的趋化能力最强。3.TSCCA+P.gingivalis+TANs组中细胞的增殖、迁移和侵袭能力最强，CXCL2/CXCR2信号轴抑制剂能够明显抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。4.动物模型验证P.gingivalis能够促进小鼠肿瘤增长，使用SCH527123干预后能够显著抑制肿瘤增长。5.TSCCA+P.gingivalis+TANs组能够通过活化CXCL2/CXCR2信号轴来激活JAK1/STAT3信号通路，使肿瘤出现EMT表型，敲低CXCL2/CXCR2信号轴能够显著降低JAK1/STAT3信号通路活化程度和逆转EMT表型。