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布鲁氏菌(Brucella)是革兰阴性兼性胞内寄生菌,能在家畜和人类间广泛传播而引起人和动物感染布鲁氏菌病。布鲁氏菌病属于慢性疾病,可能持续数周或数月,如果不能被有效治疗,就会引起肝脏,脾脏,淋巴结,骨髓,生殖系统以及骨骼系统出现病理变化。子宫内膜细胞是布鲁氏菌主要的靶细胞之一,已有的研究结果表明布鲁氏菌在宿主细胞内生存主要与宿主细胞的内质网(ER)紧密相关。布鲁菌LPS即布鲁菌脂多糖作为一种重要致病因子对布鲁氏菌在胞内生存和复制过程中起关键性作用。细菌裂解后会释放出LPS,大量LPS对脊椎动物(尤其是易感动物)的主要作用是通过与免疫细胞的特异性受体相互结合而对机体产生免疫应答。本试验通过提取布鲁氏菌的LPS侵染山羊子宫内膜上皮细胞(EEC),检测(1)内质网应激标志性分子GRP78和CHOP蛋白表达量变化,以及UPR通路中IRE1和ATF6蛋白表达变化,并对细胞自噬、凋亡以及炎症的影响;(2)加入内质网应激抑制剂4苯基丁酸(4-PBA)通过抑制内质网应激来验证内质网应激与细胞凋亡、自噬和炎症的关系。试验结果如下:1.采用热酚法提取纯化布鲁氏菌LPS,银染鉴定提取了的布鲁氏菌LPS;并用苯酚-硫酸法测布鲁氏菌未知LPS溶液浓度;通过CCK8法测布鲁氏菌LPS作用细胞的最适浓度。结果表明,成功提取布鲁氏菌LPS并测的浓度为131μg/m L,当布鲁氏菌LPS浓度达到1μg/m L,细胞活力达到85%左右,细胞状态开始发生变化。2.以布鲁氏菌LPS侵染山羊EEC,检测发现GRP78和CHOP表达在12 h显著升高(P<0.01),表明布鲁氏菌LPS能够激发EEC的内质网应激反应;进一步检测UPR相关分子,结果表明,布鲁氏菌LPS激活UPR中的IRE1和ATF6通路引起内质网应激;流式细胞术和荧光定量检测凋亡和自噬相关分子,结果表明布鲁氏菌LPS引起了EEC的凋亡和自噬;ELISA检测相关细胞炎症因子,结果表明布鲁氏菌LPS引起EEC分泌IL-1β和IL-8。3.加入内质网应激抑制剂4-PBA,通过细胞流式、RT-PCR、Western Blot和ELISA检测细胞自噬,凋亡和炎症相关因子,结果表明加入内质网抑制剂4-PBA能够抑制布鲁菌LPS刺激的EEC自噬、凋亡以及细胞炎症因子的分泌。