薄荷属(MenthaL.)植物不仅是全世界最重要的药用植物之一,也是仅次于橘类的第二大香料植物。薄荷油是薄荷的主要化学成分,在食品、制药、香料、化妆品工业上具有广泛用途。薄荷属植物存在种内和种间高频率的杂交及多倍化现象,并可无性繁殖,使得其系统进化和物种分类研究颇为困难。通过分子生物学和基因工程手段对薄荷油合成途径中的关键酶(柠檬烯合酶)进行研究,对阐明薄荷油的合成机理和薄荷属的进化及种间亲缘关系具有重要的理论价值与现实意义。1.薄荷柠檬烯合酶基因(MhLS)的克隆、生物信息学及表达分析参照已公布的欧薄荷(Mentha longifolia)中limonene synthase的序列设计引物,以薄荷(Mentha haplocalyx Briq.)栽培品种’73-8’幼嫩叶片cDNA为模板,进行PCR扩增得到一段长度为1906bp的序列。生物信息学分析发现:该序列包含1800bp的ORF,编码599个氨基酸,推导的蛋白质分子量约为70kDa、理论等电点pI为5.3;从蛋白质组成上,亮氨酸(Leu)所占比例最高,半胱氨酸(Cys)所占比例最低;氨基酸序列磷酸化位点预测显示该序列包含45个苏氨酸磷酸化位点;氨基酸序列比对发现,该序列与同属其他种的limonenesynthase氨基酸序列高度相似,并含有植物萜类合酶保守域,具有典型的类异戊二烯合成酶超家族结构域。由此推测该序列为薄荷柠檬烯合酶基因,命名为 limonenesynthase[Menthahaplocalyx Briq.](MhLS)。2.MhLS基因的分子进化分析对薄荷核基因MhLS在薄荷属内13个材料的基因结构变异及分子进化状况进行了分析。结果表明:MhLS基因的结构在所有材料间高度保守,均由7个外显子和6个内含子构成;在序列长度上,M arvensis、M.haplocalyx 1、M.haplocalyx 2、M.haplocalyx 3、M.haplocalyx 4、M.rotundifolia 1、M.rotundifolia 2、M.spicata var.crispa 2 等材料的ORF区大小为1800bp,其余薄荷属内材料的ORF区由1803个碱基组成,仅有一个三联体密码子插入差异;2个外类群长度为1812bp;薄荷属材料之间的一个三联体密码子插入事件发生在第1个外显子,其余几个外显子的碱基长度完全一致;与外类群相比较,其外显子1有2个三联体的缺失,外显子2有5个密码子的插入,外显子3有6个密码子的缺失,而外显子4-7的长度没差异;相对外显子,内含子部分则表现出更多的变化;MhLS基因全长序列范围内T、C、A、G四个碱基的含量百分比平均值分别为29.9、18.2、31.6和20.3;各个材料之间,全长序列的GC含量变化范围在35.1%-39.4%,外显子部分的变化范围为42.9%-46.5%,内含子部分为27.3%-29.2%;氨基酸密码子使用频率统计发现MhLS基因在多数氨基酸密码子使用上存在偏倚现象,同时也体现有自己的特点;碱基替换对调查结果显示MhLS基因全长序列范围内,有134个碱基位点发生转换,171个碱基位点发生颠换,变异位点数目能够提供足够的系统进化信息,从碱基替换具体类型来看,A置换成G的发生次数最多(42次),而G置换成C的转换事件发生的次数最少(10次),第三位碱基发生替换事件的频率最高,第二位的碱基发生替换的概率为最低。总体来看,MhLS基因在薄荷属内进化一致性很高,序列长度基本一致,但是各个种间DNA序列具有一定数量的变异位点,拥有足够的遗传变异信息,可以用于薄荷属系统发育分析。3.基于MhLS基因的薄荷属系统发育研究基于MhLS基因的DNA序列、编码区序列及推导氨基酸序列对薄荷属植物系统发育进行分析,利用三种不同的系统树重建方法(ML法、NJ法和MP法),分别构建了薄荷属系统发育树,获得了 一致性很高的关系树,为薄荷属种间遗传关系的诠释提供了强有力的分子证据。从整体上看,本研究中所采用薄荷属植物起源于共同的祖先,清晰地被分为4个组。第一组包括M.haplocalyx的所有4个材料和M.spicata var.crispa的2个材料(M.spicata var.cripal和M.spicata var.crispa2);第二组由M.cardiaca的2个材料和M.spicata var.crispa的2个材料即M.spicata var.crispa3和M.spicata var.crispa4组成,第一组和第二组有明显的分化节点;M.rotundifolia的两个材料组成第三组;M.arvensis独自成为第四组,处于系统树的最基部。该结果说明,M.haplocalyx与其他种材料间存在明显差异,而M.spicata var.crispa则存在种间混杂现象;两个远源材料M.rotundifolia和M.arvensis亲缘关系较近。4.MhLS基因的薄荷遗传转化构建了薄荷MhLS基因全长序列正义表达载体和全长反义片段抑制表达载体,利用携有构建好的植物表达载体(携带CaMV 35S启动子和全长MhLS基因编码序列的pCAMBIA2301重组载体)的农杆菌菌液侵染薄荷茎段。在基本培养基+3.0 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-1 IAA+25%椰乳+卡那霉素50 mg·L-1+头孢霉素500 mg·L-1条件下进行不定芽再生诱导,40d左右获得了再生不定芽,经过抗性筛选初步确认已成功获得了薄荷转MhLS基因幼苗。研究结果为今后深入研究MhLS基因在薄荷油合成途径中的功能作用,以及通过基因工程改良薄荷品种奠定了基础。