丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的慢性传染性疾病。丙型肝炎是严重威胁人类健康的常见疾病，全球约有1.7亿感染者。由于目前还没有确实有效的治疗方法，也还没有研制出疫苗，因此感染者中绝大部分可发展成慢性感染、进而部分可发展成肝硬化和肝细胞癌，因此危害极大。目前亟需发展一种有效的预防和治疗方法。 由于HCV疫苗研究的重要性，自1989年HCV基因获得克隆以来，人们一直在致力于疫苗的研究，但进展缓慢。原因是多方面的，归纳起来主要有三点：(1)HCV复制力差，体内滴度低，不易传代培养，不能大量制备。(2)HCV感染力弱，目前没有理想的细胞模型，除黑猩猩外，目前无其它易感染动物模型。(3)HCV基因具有高变异特性，以及HCV编码的不少蛋白质具有致癌性，因此，抗原的选择受到一定的限制。 当然，在HCV基因组已完全搞清、基因工程技术发展的今天，疫苗免疫原的制备应已不成问题，病毒基因表达质粒或重组病毒蛋白质均已可以大量制备。细胞和动物模型曾是影响HCV疫苗研究的又一因素，虽然目前还不能完全令人满意，但已发现不少人类细胞株，如肝细胞、T、B细胞株，可和HCV呈高亲和力结合及为HCV染感，并能为中和性抗体所中和，因此可以评第四军医大学博士学位论文 价免疫机体中和性抗体的产生。丙型肝炎病毒(HCV)基因疫苗 诱导特异性免疫应答产生己被大量的实验室证实，但普遍存在 着抗体滴度不高，CTL杀伤率不强等问题。其原因可能与HCV 感染后，抗原提呈细胞(APC)，尤其是树突状细胞(dendri tic cells，DC)数量减少、功能降低有关。如何绕过或提高DC免 疫功能低下，诱导出更强有力的、更具广泛性的免疫应答，应 当成为基因疫苗和免疫治疗鱼待解决的突出问题之一。 治疗性疫苗，是当今一个吸引人的、有着广阔应用前景的研究领域。树突状细胞作为体内重要的专职抗原提呈细胞(APC)，是机体T细胞特异免疫应答的直接启动和调控者。近年来，树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用己经成为免疫学的前沿领域，从树突状细胞中寻找免疫新分子是目前免疫学领域的一大研究热点。对DC的研究不仅有助于深刻了解机体免疫应答的调控机制，而且可以了解DC对相关疾病发生的影响从而制定相应的防治措施。 25年前Steinman和Cohn在深入地研究了DC在造血器官 组织中的分布，识别，分化和功能特点。发现它们有激发抗原 特异免疫应答的能力，非常适合作为疫苗制剂。DC干细胞在体 外容易从血液和骨髓中分离和操作，使得临床应用具有可行性。 用DC作为肿瘤疫苗制剂的实验己经开始。用药途径和剂量的选 择，给药的时间，被提呈的抗原性质，理想的成熟期是以现有 的DC生物学和从体外研究和动物模型获得的治疗作用知识为基 础的。DC免疫治疗的继续进展和精密的治疗策略将不仅依赖于 实验室研究的结果，更以人体临床试验的结果为基础。业已证 实，DC是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞，也是唯一能激 活初始T细胞的抗原呈递细胞。因此，应用抗原或抗原多肤体 外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种荷瘤宿主或带病毒特 异性抗原的宿主，进行免疫治疗;利用DC与肿瘤细胞融合成为第四军医大学博士学位论文 新型带有DC功能及肿瘤特异抗原的融合细胞瘤苗的报道;以及 利用病毒载体将带有肿瘤或病毒抗原的编码基因转染DC，使之 在DC内持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤或抗病毒免疫反应〔们等方法应运而生。这些方法存在着DC激活时间 短，治疗不彻底或利用病毒载体的安全性等问题。 病毒已经形成了许多用以逃脱宿主免疫反应的机制。这包括:减少抗原表位的表达，MHC表位的基因突变，CTL克隆的耗竭，下调 MHC一I类与MHC/肤复合物的表达，产生免疫细胞因子与受体，以及下调某些决定性的细胞因子。所以，一个理想的抗原提呈策略，应当是全方位、强有力的诱导CD扩CTL、CD扩Th及B细胞应答，这样才能更有效的清除病原体及肿瘤细胞。近年来，以免疫球蛋白(主要是工gGI)的Fc段为基础构建的新型免疫分子进展很快，有望用于新型免疫复合制剂的研制。工gGI的Fab与FC是功能相对独立的片段，Fab中的可变区负责与抗原结合，而Fc段能与免疫效应细胞的F。Y受体(Fc YR)结合，发挥其调节免疫效应、细胞炎症反应、细胞毒效以及激活吞噬细胞的作用。DC本身表面带有Fc丫R，因此由FC YR介导的吞噬细胞内在化的过程可加强免疫应答的抗原提呈。 本研究旨在构建出包含fJCVC一Fc融合基因的可分泌型真核 表达载体，转染经体外活化的DC，利用已建立的表达HCvC抗 原的靶细胞(SPZ/O一HCV一C)及HCV感染荷瘤鼠(BALB/c小鼠)模 型，观察HCVC一Fc融合基因疫苗修饰的DC，诱导的特异性CTL、 抗体强度，以及对T细胞的增殖作用。研究基因疫苗转染前后， DC对抗原提呈作用的变化，探索HCVC一Fc融合基因疫苗修饰的 DC，用于预防和治疗HCV感染的可能性和可行性。 研究内容及实验结果如下: 1本文选用人工gGIFc段基因作为目的基?