苹果是世界上最重要的水果之一。苹果常规育种工作由于童期长、遗传背景复杂而效率较低,而植物生物技术的发展为苹果育种开辟了一条新的途径。随着现代分子生物技术的飞速发展,克隆、鉴定目的基因、将目的基因转化到植物中并获得转基因工程植株,使植物育种取得了突破性进展。 本实验首先建立了苹果砧木罗 6 和珠美海棠的高效稳定的再生体系,研究了各个影响因子对再生频率的影响,找出最佳的组合条件,得到了较高的再生频率,为 BADH 基因的转入打下了良好的基础。通过农杆菌介导法将 BADH 基因导入叶片中,研究转化过程中的各个影响因子,优化了农杆菌介导的苹果基因转化条件,得出了最佳组合条件,得到了抗性植株。主要结果如下:1.建立了苹果砧木高效稳定的再生体系。(1)激素对再生的影响:由不同的细胞分裂素和生长素组成不同的激素组合,研究激素对再生的影响,通过实验发现罗 6 在 BA6.0mg/L+NAA0.2mg/L 的条件下再生频率为 85%,珠美海棠在 BA3.0 mg/L + NAA0.3mg/L 时达到 90%。细胞分裂素是叶片再生所必需的,也是影响叶片再生频率的重要因子,本实验发现 BA 在 0~6.0 mg/L 范围内,随着 BA 浓度的提高再生频率也不断升高,当BA浓度达到6.0 mg/L时再生频率达到最高,但 BA 浓度过高反而使再生频率下降,而且极易导致再生苗发生玻璃化,小苗出现畸形,生长不良。对珠美海棠而言,最适宜的 BA 浓度为 3.0mg/L,NAA 为 0.3mg/ L,随 BA 浓度的升高,再生频率先升高而后有所下降,并没有罗 6 那样有规律性的表现,而且激素变动时,再生频率变化的幅度不太很大,这也许与基因型有关。(2)黑暗处理对叶片再生的影响:通过研究不同黑暗处理时间对叶片再生的影响,发现叶片接种后先进行一段时间的黑暗处理十分重要,而且以 2周为宜。暗培养时间如果较长,有些愈伤组织也会在黑暗条件下直接分化不定芽,但这些不定芽见光后生长不健壮,易死掉。叶片一直在光下培养则形成极少量的愈伤组织,而且这些愈伤组织极易老化,很难再生不定芽。(3)操作方式对叶片再生的影响:本实验发现切割明显促进叶片愈伤组织 1<WP=9>王艳:苹果砧木品种 BADH 基因遗传转化的研究的产生,对再生有明显的促进作用。放置方式对叶片的再生也有影响,而且发现正放再生效果远远优于反放,而且在罗 6 和珠美海棠的实验中影响结果是一致的。(4)基本培养基对再生的影响:研究了 MS,N6,B5 3 种基本培养基对叶片再生的影响,结果表明 MS 对叶片再生的促进效果明显优于 N6 和 B5,在 MS 培养基上叶片的再生频率达到 85%以上。(5)基因型对再生的影响:实验证明罗 6 的最适宜组合为 BA 6.0mg/L +NAA0.2 mg/L,再生频率为 85%,而珠美海棠在此组合中的再生频率为61.25%;而珠美海棠则在 BA3.0mg/L +NAA0.3 mg/L 时再生频率为 90%,而罗 6 在此组合中的再生频率为 52.67%;在相同的培养条件下,罗 6、珠美海棠的再生频率也差异较大,从整体上看珠美再生频率高于罗 6,最高平均达到 90%以上。(6)叶片的大小和质地对再生的影响:在相同条件下对于同种外植体的不同部位、不同的生理状态及成熟度都有不同的再生效果。实验结果发现中等大小的叶片再生效果明显优于其它叶片;幼嫩叶片再生效果明显优于较老的叶片。2.农杆菌介导的苹果遗传转化。(1) 抗生素的敏感度实验:通过实验发现,苹果对卡那霉素特别敏感, 5mg/L 足以抑制叶片再生,所以采用两步筛选法,分化时的卡那霉素 为 5mg/L,当不定芽长到 2~3 厘米时卡那霉素采用 40mg/L。通过研究 不同浓度的头孢霉素对农杆菌的抑制效果,确定头孢霉素 300 mg/L 为 宜。(2) 侵染时间对转化的影响:通过研究发现侵染时间对转化率的影响,发 现侵染 10 分钟具有最高的转化率。(3) 乙酰丁香酮(AS)对转化的影响:常用的 Vir 区基因诱导物是 AS,结 果表明乙酰丁香酮 10 mg/L 对基因转化有较大的促进作用,浓度过大 反而有抑制作用。(4) 材料的侵染方式对转化的影响:通过对材料进行不同的侵染方式发现 摇动+深层菌液效果最佳,这样菌液可以充分接触材料。(5) 预培养时间对转化的影响:外植体的预培养时间与其效果有明显关系, 2<WP=10>山东农业大学硕士学位论文 实验结果发现预培养 2~3 天效果最佳。(6)共培养对转化的影响:共培养对转化也有影响,结果表明共培养以 2~3天为宜,具体按照叶片周围农杆菌的生长情况而定,以叶片周围刚见农杆菌为宜。3.改进后农杆菌介导苹果遗传转化的具体方法: 外植体预培养 2 天 将叶片在摇好的新鲜菌液中侵染 10 分钟 将叶片的菌液吸干 共培养 2~3 天 初步选择(卡那霉素为 5mg/L,培养基为分化培养基) 抗性筛选(卡那霉素为 40 mg/L,快繁培养基) 进行分子检测