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目的:1.利用离子影像系统(Ion Imaging system),建立测定单细胞内活性氧含量的方法;2.建立模拟心肌缺血/再灌注以及氧化应激模型,给予抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH),用双波长比例测量法测定单个心室肌细胞内活性氧含量的变化,以验证此方法的可行性。方法:1.采用酶法急性分离成年大鼠心室肌细胞。以含钙1.8mM的台氏液制备细胞悬液,加入10μM的荧光染料二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(2’,7’-Dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA),(同时加0.2%BSA以防止DCFH-DA由细胞内外漏),35℃恒温负载15分钟后,以台氏液清洗三次,洗去细胞外多余的染料,进行实验。2.用含双氧水(10mM)的台氏液灌流细胞,造成氧化应激。设定激发光波长从340nm到580nm,以20nm波长的间隔递增,对细胞进行荧光激发,用离子影像系统测定荧光信号,选择荧光强度值最大和最小的两个激发光波长。3.模拟心肌缺血/再灌注模型:用含乳酸(20mM),pH值为6.6的缺血台氏液灌流细胞模拟缺血,20分钟后换用正常台式液(pH值为7.4)灌流。氧化应激模型:用含双氧水(10mM)的台氏液灌流细胞。用离子影像系统测定上述各模型心室肌细胞不同时期以及应用抗氧化剂还原型谷胱甘肽(GSH)后活性氧含量的变化。结果:1.用离子影像系统测定负载化学荧光指示剂DCFH-DA心室肌细胞的荧光信号,荧光强度值最大和最小的两个激发光波长分别是:480nm和420nm,所以选择这两个波长作为用双波长比例测量法测定心室肌细胞内活性氧含量的两个激发光波长,以F480/F420的比值表示活性氧的含量。2.模拟心肌缺血再灌注模型,用双波长比例测量法测定的结果为:心室肌细胞在模拟缺血期和恢复再灌注期的F480/F420分别为缺血前的115.27±4.52%和116.99±3.99%,二者间没有统计学意义。若在再灌注期给予含有抗氧化剂GSH(0.8mM)的台式液,则活性氧含量降为缺血前的101.14±3.20%,明显低于单纯台氏液再灌注组(p < 0.05)。3.建立氧化应激模型,用双波长比例测量法测定的结果为:心室肌细胞在氧化应激期活性氧含量(F480/F420)为刺激前的132.56±4.33%,换用台氏液继续灌流,活性氧含量(F480/F420)仍然保持较高水平,为刺激前的132.91±4.32%,二者间没有统计学意义。若在双氧水刺激后用含有抗氧化剂GSH(0.8mM)的台氏液灌流细胞,活性氧含量则下降至刺激前的100.12±5.91%,明显低于氧化应激期(p < 0.05)。结论:1.应用离子影像系统,以DCFH-DA作为化学荧光指示剂,可以探测细胞内活性氧含量的变化。2. 480nm和420nm是用双波长比例测量法测定单细胞内活性氧含量的两个最适激发波长,可以F480/F420的比值表示活性氧的含量。3.建立模拟心肌缺血/再灌注及氧化应激模型,在再灌注期及氧化应激后加入抗氧化剂还原型谷胱甘肽,用双波长比例测量法可以检测到细胞内活性氧的变化,证明此方法可以用于测定心室肌细胞内活性氧的含量。