【摘 要】
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急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是成人最常见的血液系统恶性肿瘤,伴随化疗、造血干细胞移植和支持治疗的不断优化,5年总生存率也仅有15%～30%。白血病细胞耐药是造成AML复发/难治的主要原因,寻找耐药相关的靶点并靶向治疗非常必要。酪氨酸激酶受体Axl在多种类型的肿瘤包括AML中表达上调,与肿瘤的转移、不良预后和耐药密切相关,从而成为值得探索的治疗靶点。研究目的
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急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是成人最常见的血液系统恶性肿瘤,伴随化疗、造血干细胞移植和支持治疗的不断优化,5年总生存率也仅有15%～30%。白血病细胞耐药是造成AML复发/难治的主要原因,寻找耐药相关的靶点并靶向治疗非常必要。酪氨酸激酶受体Axl在多种类型的肿瘤包括AML中表达上调,与肿瘤的转移、不良预后和耐药密切相关,从而成为值得探索的治疗靶点。研究目的本研究针对AML的耐药复发问题,提出以Axl为靶点的治疗策略,通过对比观察人AML细胞系敏感株、耐药株以及不同临床特征AML患者原代细胞Axl抗原的表达情况,选定Axl抗原高表达的伴有FLT3突变的AML作为Axl靶向治疗的疾病类型,并进一步研究新型抗Axl抗体DAXL-88、DAXL-88-MMAE以及Axl小分子抑制剂R428对伴有FLT3突变的AML细胞系和AML患者原代细胞的杀伤作用和分子机制,为临床精准治疗AML提供依据。研究方法1、采用化疗药物短程冲击法和FLT3（fms-like tyrosine kinase 3）抑制剂持续诱导法诱导AML耐药细胞株,分离AML患者新鲜骨髓/外周血原代细胞并层递降温冻存,流式细胞仪检测AML细胞系耐药株与敏感株,以及不同临床特征AML患者原代细胞Axl抗原表达情况并进行对比。2、CCK8（cell counting kit-8）法检测DAXL-88、DAXL-88-MMAE、R428对不同特征、不同抗原表达强度AML细胞系和AML原代细胞的杀伤作用;检测联合FLT3抑制剂AC220对FLT3-ITD（internal tandem duplication）+AML细胞系和原代细胞的协同杀伤作用。3、流式细胞术检测DAXL-88、DAXL-88-MMAE、R428单药或联合AC220对FLT3-ITD+AML细胞系和原代细胞的诱导凋亡作用。4、Western blotting检测DAXL-88、DAXL-88-MMAE、R428单药或联合AC220对FLT3-ITD+AML细胞系和原代细胞Axl及其下游信号转导通路的抑制。研究结果1、K562/ADM、U937/Ara-c、MV4-11/AC220耐药株与K562、U937、MV4-11敏感株相比,Axl抗原表达显著上调;FLT3-ITD/TKD（tyrosine kinase domain）+AML原代细胞和FLT3-ITD/TKD-AML原代细胞相比,Axl抗原表达更高;临床典型FLT3-ITD+AML患者原代细胞Axl抗原表达的动态变化与其临床上对FLT3抑制剂耐药相吻合。2、DAXL-88对FLT3-WT+THP-1、FLT3-ITD+MV4-11和MV4-11/AC220细胞系,以及FLT3-ITD+AML原代细胞的杀伤呈剂量依赖性,推测其杀伤机制可能是通过空间位阻影响细胞Axl与FLT3之间的物理作用,阻断异源二聚体的形成,抑制Axl和FLT3的磷酸化及其下游Akt、Erk的磷酸化,从而诱发凋亡。3、DAXL-88-MMAE对有Axl抗原表达的AML细胞系和AML原代细胞的杀伤呈剂量依赖性,杀伤活性与细胞对MMAE（monomethyl auristatin E）的敏感性有关,与Axl抗原的表达强度无关,杀伤机制主要通过Axl介导的MMAE毒性作用。4、R428对AML细胞系和AML原代细胞的杀伤呈剂量依赖性,对MV4-11/AC220耐药株和耐药FLT3-ITD+AML原代细胞杀伤活性降低,可能存在不依赖Axl的其他的杀伤机制。5、DAXL-88、DAXL-88-MMAE、R428与FLT3抑制剂AC220联合呈协同杀伤和诱导凋亡效应,可有效克服MV4-11/AC220耐药株和耐药FLT3-ITD+AML原代细胞的耐药。结论1、Axl抗原表达上调与FLT3-ITD/TKD+AML,尤其是耐药FLT3-ITD+AML密切相关,靶向Axl具有临床意义。2、用新型抗Axl抗体DAXL-88、DAXL-88-MMAE和Axl小分子抑制剂R428靶向Axl可以有效杀伤伴有FLT3突变的AML细胞系和FLT3-ITD+AML原代细胞,联合FLT3抑制剂AC220具有协同杀伤和诱导凋亡作用,可有效克服MV4-11/AC220耐药株和耐药FLT3-ITD+AML原代细胞的耐药。
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