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目的 根据等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR,ASPCR)原理设计引物,检测广西HIV-1 CRF01_AE亚型pol基因逆转录酶区主要耐药突变,探索利用ASPCR法检测艾滋病耐药位点的可行性,为临床耐药检测和耐药流行病学调查提供快速、灵敏、高效、低成本的检测技术。方法利用不含耐药突变HIV-1 CRF01_AE亚型pol基因片段和pUCm-T载体,构建HIV-1 CRF01_AE亚型pol基因野生型质粒。对所构建的野生型克隆质粒进行定点突变,获得含耐药突变位点的突变型质粒。根据ASPCR原理,设计通用下游引物以及针对每一突变位点的特异性上游引物,包含野生型检测引物和突变型检测引物。以构建的野生型质粒和各种突变型质粒为模板,使用PCR法评价所设计的引物,筛选出特异性强、灵敏度高的引物。选取少量艾滋病HARRT治疗患者,同时使用直接测序法和ASPCR法检测耐药突变,通过比较验证引物的有效性。结果1.成功构建含HIVCRF001_AE亚型pol基因的PUCm-T质粒,包括不含耐药突变的野生型质粒和19个含逆转录酶区耐药突变位点的突变型质粒,所有克隆经过测序鉴定;2.针对逆转录酶区19个位点,设计了一条通用下游引物以及每一位点的野生型引物和突变型引物各两条。19个突变位点包括NRTIs耐药突变10个,分别为 M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y、T215F; NNRTIs 耐药突变 9 个,分别是 K103N、V108I、E138A、V179D、Y181C、Y188C、G190A、G190R、M230I;3.在19个耐药位点中,有15个位点分别筛选出一条特异性良好的野生型引物,其中,M184V位点和M184I位点、G190R位点和G190A位点、T215Y位点和T215F位点的野生型引物相同。有16个位点分别筛选出一条灵敏度高的突变型引物,其中3个位点的检测灵敏度达1%突变样本,9个位点的检测灵敏度达5%突变样本,4个位点的检测灵敏度达10%突变样本;4. 23例临床样本中,采用直接测序法检出6例K103N突变、9例Y181C突变和5例G190A突变。采用本项目建立的ASPCR法检出4例K103N突变、7例Y181C突变和5例G190A突变,与测序法的一致性分别为66.6%、77.8% 和 100%。结论本研究探索了基于ASPCR原理建立HIV-1耐药突变检测方法,成功设计了可用于检测CRF01_AE亚型逆转录酶区15个主要耐药突变位点的引物组合,为下一步建立固相多重ASPCR芯片检测HIV-1耐药突变奠定了基础。