猪肝酯酶(Pig Liver Esterase，简称PLE)是手性催化工业中最常用的三种生物催化剂之一。它是从猪肝中提取出来的一种羧酸酯水解酶(EC 3．1．1．1)，具有很强的手性选择水解能力。 纯的PLE具有高的催化活性，为了得到单一纯组分蛋白，设计构建基因工程菌株以快速高效得到PLE。甲醇酵母表达系统是最近迅速发展起来的一种真核表达系统，它能以甲醇为唯一碳源大量合成蛋白质，已用于表达多种外源蛋白，被认为是最具发展前景的蛋白质生产工具之一。针对PLE这一真核生物的糖蛋白，本实验选用Invitrogen公司的Phichia pastoris Multi-copy Expression System克隆表达PLE，使PLE能够得到正确的翻译后加工和修饰。 从新鲜猪肝组织中提取总RNA，并设计嵌套引物进行RT-PCR。目的片断与载体pPIC9K，连接并转化入E.coli JM109，得到含有PLE基因的重组质粒pPIC9K-PLE。该质粒经双酶切、不同引物的PCR扩增、NcoⅠ酶切等方法鉴定，以及DNA测序，证明pPIC9K-PLE表达载体构建成功。 pPIC9K-PLE经线性化后，电击转化入甲醇酵母GS115中，通过MD平板筛选、PCR扩增鉴定，证明pPIC9K-PLE成功整合入GS115中。阳性转化子经发酵诱导，PLE表达量达450mg／L，且纯度高，分子量在60kDa左右，发酵液上清酶活力达2.21U／ml。 本实验获得的结果为PLE的下一步开发利用打下了基础。