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目的:肾小管间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)几乎是所有慢性肾病发展到终末期肾病的主要病理基础之一。近年来大量研究表明,小管间质纤维化与肾功能的损害密切相关。肾小管间质纤维化表现为间质成纤维细胞增多,使基质蛋白合成分泌增加和/或降解减少,大量沉积于间质内,而导致间质纤维化的产生。所以间质成纤维细胞的增多是小管间质纤维化的病理基础。越来越多的研究证实肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转化(epithelial myofibroblast transition,EMT)是肾小管成纤维细胞增多的一个重要机制。所以研究EMT的分子机制,对于进一步了解和延缓肾间质纤维化进程,探索有效的防治措施,延长患者寿命有重大意义。但是肾小管EMT的信号转导机制是十分复杂的,目前对其还了解甚少。JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activators of transcription)是细胞内一条重要的信号通路,与许多细胞的增殖、凋亡和转分化有关。但在肾小管EMT发生机制中的研究尚少;PI3K/AKT(Phosphoinositide3 -kinase/ProteinkinaseB)通路介导了多种上皮来源的恶性肿瘤细胞转分化的发生,同时该通路与肾脏小管上皮细胞的增殖、凋亡关系密切,但与肾小管EMT的关系尚不明确;多种细胞外因子能够导致上皮细胞转分化的因子较多,如TGF-β1、糖基化终产物、ILK、血管紧张素II等等,但TGF-β1是最明确和最重要的导致上皮细胞转分化的因子。为了更好地了解JAK/STAT和PI3K/AKT信号传导通路在肾小管上皮细胞EMT发生发展过程中的作用,本研究采用体外培养大鼠肾脏近端小管上皮细胞(NRK-52E)细胞株,并用重组人TGF-β1因子诱导其进行EMT。通过观察EMT过程中JAK/STAT和PI3K/AKT信号转导途径相关因子的变化,以及细胞表型的转变,来探讨JAK/STAT、PI3K/AKT途径在肾脏小管上皮细胞EMT过程中的作用。从而为阻断上皮细胞转分化,防止和延缓肾脏纤维化提供理论指导和参考价值。方法:体外培养大鼠肾脏近端小管上皮细胞细胞株NRK-52E及CK18、α-SMA、AKT、P-AKT、JAK、P-JAK2、P-STAT1、P-STAT2的检测1 TGF-β1(10ng/ml)刺激细胞,分别于刺激0h、6h、12h、24h、48h后提取细胞总蛋白和总RNA,通过Western blotting和RT-PCR实验,观察TGF-β1对细胞表型标志蛋白(CK18、α-SMA)的蛋白及mRNA在不同时间段的表达情况。2 TGF-β1(10ng/ml)刺激细胞,分别于刺激0min、10min、30min、1h、2h和4h后提取细胞总蛋白观察,通过Western blotting实验,观察细胞内信号转导因子(AKT、P-AKT、JAK、P-JAK2、STAT1、P-STAT1)在TGF-β1刺激后的表达和磷酸化的情况。3用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002和JAK/STAT通路抑制剂AG490对细胞进行抑制,之后将细胞分成4组:空白组(N);TGF-β1(10ng/ml)刺激组(T);TGF-β1+LY294002(20μmol/L)组(T+LY);TGF-β1+AG490(10μmol/L)组(T+AG),于刺激1小时后提取细胞总蛋白,通过Western blotting和免疫细胞化学(ICC)实验观察细胞内信号转导因子AKT、P-AKT的表达和磷酸化的情况;于刺激30min后提取细胞总蛋白,通过Western blotting和ICC实验观察细胞内信号转导因子JAK、P-JAK2、STAT1和P-STAT1的蛋白表达和磷酸化的情况。4用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002和JAK/STAT通路抑制剂AG490对细胞生长进行干预,之后将细胞分成6组:正常组(N);TGF-β1(10ng/ml)刺激组(T);TGF-β1+LY294002(20μmol/L)组(T+LY);TGF-β1+AG490(10μmol/L)组(T+AG);LY294002(20μmol/L)对照组(LY);AG490(10μmol/L)对照组(AG),于刺激48小时后提取细胞总蛋白和总RNA,通过Western blotting和RT-PCR实验观察细胞表型CK18和α-SMA的蛋白及mRNA在不同培养条件下的表达情况。体外培养NRK-52E,用含10%的胎牛血清配以100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基培养,刺激前先用无血清DMEM培养基同步培养24h,刺激30min或1小时组别的细胞给予无血清培养,刺激48小时组细胞给予2%低浓度血清。结果:1α-SMA和CK18蛋白及mRNA在TGF-β1刺激后表达的改变。Western Bloting检测:α-SMA蛋白表达量在刺激6小时后开始上调,并随着刺激时间的延长,表达量逐渐升高;CK18蛋白表达量在刺激6小时后开始下降,并随着刺激时间的延长,表达量逐渐降低。RT-PCR检测:α-SMA mRNA的表达量在刺激6小时后开始上调,并随着刺激时间的延长表达量逐渐升高;CK18 mRNA的表达量在刺激6小时后开始下降,并随着刺激时间的加长,表达量逐渐降低。2 AKT、JAK、P-AKT、P-JAK2、STAT1、P-STAT1在TGF-β1刺激后的蛋白表达及磷酸化情况。Western Bloting检测:P-AKT的蛋白活化水平在刺激10min后便有升高,并于刺激后1小时达到峰值,此后逐渐衰减;P-JAK2蛋白的活化水平在刺激10min后就明显升高,并于刺激后30min后达到峰值,并随着刺激时间的延长而表达量逐渐降低; P-STAT1蛋白的活化水平在刺激10min后就有明显升高,并于刺激后30min后达到峰值,并随着刺激时间的延长而表达量逐渐降低。而AKT、JAK、STAT1蛋白在TGF-β1刺激后表达量无显著变化。3 AKT、p-AKT蛋白在TGF-β1刺激1h和分别加用抑制剂LY294002和AG490后含量的改变;JAK、P-JAK2、STAT1、P-STAT1的蛋白在TGF-β1刺激30min和分别加用抑制剂LY294002和AG490后含量的改变。Western Bloting检测:刺激组(T)P-AKT、P-JAK2、P-STAT1的蛋白活化水平明显高于正常组(N),T+LY和T+AG组中P-AKT、P-STAT1的活化较刺激组明显下降,但较正常组高;P-JAK2在T+Y组中的活化量较刺激组并无显著差别。ICC观察:结果与Western Bloting结果相对应。4α-SMA和CK18的蛋白及mRNA在TGF-β1刺激和加用抑制剂LY294002和AG490后表达量的改变。Western Bloting检测:α-SMA蛋白在N组几乎没有表达或表达甚微,TGF-β1刺激后表达量明显升高,而在刺激基础上加用LY294002和AG490后,表达量受到很大程度地抑制,对照组基本没有表达或表达甚微;CK18蛋白在N组表达较高,TGF-β1刺激后表达量明显下降,而加用LY294002和AG490后,表达量明显回升,对照组和正常组相比无显著差异。RT-PCR检测:α-SMA mRNA在N组几乎没有表达或表达甚微,TGF-β1刺激后表达量明显升高,加用LY294002和AG490后,表达量受到很大程度地抑制,而对照组基本没有表达或表达甚微;CK18 mRNA在N组表达较高,TGF-β1刺激后表达量明显下降,加用LY294002和AG490刺激后,表达量明显回升,而对照组和正常组相比无显著差异。结论:1重组TGF-β1因子可使NRK-52E细胞肌成纤维细胞表型标志蛋白α-SMA表达升高,上皮细胞表型标志蛋白CK18表达下降,提示EMT的发生。2 PI3K/AKT和JAK/STAT通路通过AKT、JAK2、STAT1磷酸化的方式激活,参与调控肾小管上皮细胞的EMT过程;抑制PI3K/AKT和JAK/STAT通路后,EMT也受到相应抑制。3 JAK/STAT通路抑制剂AG490可使AKT、JAK2、STAT1的磷酸化受到较大程度地抑制;PI3K/AKT通路抑制剂LY294002可使AKT、STAT1的磷酸化受到抑制,但对JAK2的磷酸化抑制不明显。提示两条通路存在cross talk,JAK2有可能作为AKT的一个上游因子参与了AKT的磷酸化激活。但这两条通路间的相互机制有待进一步研究。