氟虫氰衍生物亲和柱的制备及其在GABA受体分离中的应用

来源 :上海师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:stanley_lippman
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y-氨基丁酸(aminobutyirc acid,GABA)受体是多种杀虫剂的重要作用K标。因此,从生物体中分离纯化GABA受体,并对其立体结构进行研究,为幵发高效、低毒、安全农药以及克服害虫的抗药性等方面具有极大的指导意义。本文以鳙鱼为研究材料,探究GABA受体的亲和柱分离方法。通过文献调研,总结GABA受体分离纯化的方法,利用计算化学的方法,从相关文献报道的小分子中,确定亲和层析使用的配体为氟虫氰衍生物。经过基质的活化、偶联和封闭等过程制备出亲和层析的介质,并研究了亲和层析柱的应用条件,最终确定其最佳使用条件。基质的活化:选择Sepharose CL-6B作为亲和层析柱的基质,1,4-丁二醇二缩水甘油醚作为活化剂,将其接连接于基质上。活化后Sepharose CL-6B上含有的环氧基密度为64.26pmo丨/g胶。研究活化温度、时间及pH值等条件对活化效率的影响。最终确定1,4-丁二醇而缩水甘油酸活化Sepharose CL-6B的最佳实验条件为:10.0g Sepharose CL-6B、10.0mL0.3mol/L的NaOH溶液和20mg NaBH4混合,再加入10.0mL1,4-丁二醇二缩水甘油醚和10.0mL DMSO°,37C条件下170rpm振荡反应8h。偶联与封闭:活化后的Sephaorse CL-6B上环氧基与氟虫氰衍生物末端的伯氨基反应,将氟虫氰衍生物固定在Sephaorse CL-6B上,然后用1mol/L乙醇胺溶液封闭残余的环氧基,最终氟虫氰衍生物的偶联度为58.68pmol/g胶。亲和层析柱分离:将制备好的亲和层析介质氣虫氰衍生物-Sepharose CL-6B装柱,对鳙鱼脑组织内的GABA受体进行分离纯化。通过亲和层析和离子交换层析,所得目的蛋白质的浓度为4.6^ig/mL,总质量为138pg。凝胶电泳之后得到分子量分别为44kD和55kD的两个条带,与文献上报道的其他生物对应亚基的分子量相近,分析所得条带可能为鳙鱼GABA受体的a和p亚基。本文的创新点在于首次利用氟虫氰衍生物作为配体,制备亲和层柱,从鳙脑组织中分离得到(;ABA受体,并对各个亚祛的分子量进行了鉴定。
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