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目的：叶酸(Folate, FA)在中枢神经系统(Central nervous system, CNS)发育过程中扮演重要的角色,孕期缺乏叶酸会增加胎儿发生神经管缺陷的危险,这是导致围生儿死亡的主要原因。目前基础研究主要集中于叶酸对神经元细胞作用的探讨,而对少突胶质细胞(Oligodendrocytes, OLs)的作用鲜有报道。我们前期研究发现,叶酸缺乏可引起少突胶质细胞发育障碍,相反充足叶酸在促进少突胶质细胞发育成熟的同时明显上调其潜在的下游靶蛋白二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase, DHFR)的表达,这提示FA/DHFR在少突胶质细胞发育过程中发挥了重要的作用。因此本课题欲在此基础上,深入探讨FA/DHFR对少突胶质细胞发育和再髓鞘化过程中的影响,并发现FA/DHFR促进少突胶质细胞发育的分子机制,为叶酸在神经系统发育过程中的作用研究提供理论依据,也为预防和治疗CNS中髓鞘损伤相关的神经系统疾病提供新的思路。方法：1. FA/DHFR在少突胶质细胞发育和再髓鞘化过程中的作用研究1)给予不同浓度叶酸饲料(02 mg/kg 和 40 mg/kg)喂养孕鼠,采用免疫染色、qRT-PCR和原位杂交技术检测胎鼠或仔鼠脊髓中少突胶质细胞的发育情况；2)应用qRT-PCR、western blot和免疫荧光技术评价体外叶酸对少突胶质细胞成熟的影响；3)应用qRT-PCR 和 western blot分别检测体内外给予叶酸后DHFR的变化情况；4)采用免疫荧光技术检测DHFR在CNS中少突胶质细胞丰富区域的表达情况；5)采用qRT-PCR 和 western blot评价体外给予DHFR特异性抑制剂甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)对少突胶质细胞的影响；6)给予孕鼠腹腔注射MTX构建FA/DHFR抑制模型,采用Elisa和qRT-PCR验证模型成功构建,进而采用免疫染色和透射电镜技术评价少突胶质细胞的发育情况和髓鞘的完整性；7)采用免疫染色技术评价叶酸能否对抗DHFR抑制引起的少突胶质细胞损伤；8)采用双环已酮草酰二腙(Cuprizone, CPZ)诱导的脱髓鞘模型评价叶酸的预防治疗作用,采用CPZ诱导的髓鞘损伤后修复模型评价MTX的延缓修复作用。2. FA/DHFR调控少突胶质细胞发育的分子机制研究1)采用免疫荧光和western blot技术检测DHFR抑制后少突胶质细胞的凋亡和分化情况；2)采用免疫荧光和H&E染色技术检测DHFR抑制后少突胶质细胞的增殖情况和脊髓的炎症反应；3)采用免疫荧光技术检测p-AMPKa在少突胶质细胞中的表达情况；4)采用western blot技术检测体内外给予叶酸或MTX后AMPK信号通路的变化情况；5)将Oli-neu细胞转染AMPKal质粒或sh-RNA进行过表达或敲除AMPKal,采用qRT-PCR技术检测AMPK信号对少突胶质细胞的影响；6)采用Oli-neu细胞体外评价AMPK激动剂AICAR和二甲双胍(Metformin, MET)能否对抗DHFR抑制引起的少突胶质细胞损伤；7)采用体内模型评价MET是否有效逆转DHFR抑制引起的少突胶质细胞损伤。结果：1. FA/DHFR在少突胶质细胞发育和再髓鞘化过程中的作用研究1)叶酸调控少突胶质细胞分化发育给予低浓度叶酸(02 mg/kg)或高浓度叶酸(40 mg/kg)饲料喂养孕鼠检测新生仔鼠CNS中少突胶质细胞的发育情况,结果显示相对于正常饲料喂养的仔鼠,低浓度叶酸明显阻碍少突胶质细胞的发育进程,相反高浓度叶酸显著促进少突胶质细胞的发育。随后采用体外原代OPCs细胞分化培养的方法考察叶酸的作用,结果表明相较于低浓度叶酸(002 μg/ml)组,高浓度叶酸(50μg/ml)组明显增加少突胶质细胞标记物Olig2的表达和髓鞘蛋白MBP和CNP的表达。以上结果提示叶酸在少突胶质细胞的发育过程中扮演了重要的角色。2)叶酸下游潜在靶点DHFR参与调控少突胶质细胞发育和髓鞘化采用qRT-PCR检测高叶酸饲料喂养的仔鼠脊髓中叶酸代谢通路中几个关键因子的表达,结果表明仅dhfr基因表达明显上调。随后我们给予Oli-neu细胞不同浓度的叶酸,qRT-PCR 和 western blot结果显示少突胶质细胞标记物的mRNA和蛋白水平都明显增加,并且DHFR蛋白表达也上调。这提示DHFR可能参与叶酸调控少突胶质细胞发育的作用。免疫荧光染色结果表明DHFR可以表达在少突胶质细胞的胞浆中,而在星形胶质细胞中不表达；并且D HFR在CC1+的成熟少突胶质细胞内表达较强,而在PDGFRa+的未成熟少突胶质细胞内表达较弱。转染DHFR质粒可以促进Oli-neu细胞正性调控基因的表达,抑制负性调控基因的表达；而采用DHFR特异性抑制剂MTX抑制DHFR可以下调Oli-neu细胞调控基因和蛋白的表达,并呈现一定的剂量依赖关系。给予孕鼠腹腔注射经典DHFR抑制剂MTX,结果表明给予MTX后DHFR的mRNA和蛋白水平都显著下调,同时血清中的叶酸水平也明显减少,且呈现一定的剂量依赖关系。免疫染色结果表明DHFR抑制后少突胶质细胞标记物明显减少,并且随着年龄的增大损伤加剧。透射电镜结果表明抑制DHFR明显破坏了髓鞘的完整性。同时免疫染色结果显示叶酸可以部分逆转DHFR抑制引起的少突胶质细胞损伤。以上结果提示DHFR参与调控少突胶质细胞的发育和髓鞘化过程。3) FA/DHFR在脱髓鞘模型中的应用在CPZ诱导的脱髓鞘模型中灌胃给予叶酸(10 mg/kg/d)可以有效缓解脱髓鞘症状,这提示叶酸对髓鞘损伤有一定的保护作用。在CPZ诱导的髓鞘损伤后修复模型中给予MTX(4mg/kg/3d)可以明显阻碍髓鞘的自动修复,这提示DHFR可能在再髓鞘化过程中发挥一定的作用。2. FA/DHFR调控少突胶质细胞发育的分子机制研究1)抑制DHFR引起少突胶质细胞凋亡和分化障碍TUNEL和荧光染色结果表明抑制DHFR诱导少突胶质细胞发生凋亡和分化障碍,进而western blot验证抑制DHFR使少突胶质细胞大部分处于未分化状态。BrdU荧光染色及其计数结果表明抑制DHFR不影响少突胶质细胞的增殖过程,H&E染色结果表明抑制DHFR不引起炎症反应。2) FA/DHFR通过调控AMPKa信号影响少突胶质细胞发育免疫荧光结果表明p-AMPKa可以在少突胶质细胞中表达。Western blot结果表明叶酸可以激活AMPKa信号,相反的抑制DHFR可以抑制AMPKa信号。转染AMPKal质粒激活AMPKa信号后可以促进Oli-neu细胞相关调控因子表达,而转染AMPKal sh-RNA沉默AMPKal信号后可以下调Oli-neu细胞相关调控因子表达。随后体外采用AMPK信号激动剂MET 和 AICAR孵育Oli-neu细胞,结果表明MET和AICAR均可以逆转DHFR抑制引起的Oli-neu细胞相关调控因子的下调。进而体内采用腹腔注射MET (100 mg/kg/d)观察其能否对抗DHFR抑制引起的损伤,qRT-PCR结果显示AMPKα1的mRNA水平在给予MET后有了明显的回调,同时免疫组化和LFB染色结果均表明与MTX组相比,给予MET后少突胶质细胞标记物表达和髓鞘区域都有了明显增加。以上结果提示AMPKα信号参与到FA/DHFR调控少突胶质细胞的发育过程中。结论：本课题首次从体内外发现并证实了FA/DHFR促进少突胶质细胞发育和髓鞘化的作用,并且FA/DHFR的调控作用在脱髓鞘模型中得到了验证,紧接着对FA/DHFR调控少突胶质细胞发育的相关分子机制进行了深入的探讨。我们发现抑制FA/DHFR可以引起少突胶质细胞发生凋亡和分化障碍,进而AMPKα信号在FA/DHFR的调控作用中发挥了重要作用,并且AMPKα激动剂体内外均可以有效逆转FA/DHFR抑制引起的少突胶质细胞损伤。综上所述,本课题阐述了FA/DHFR/AMPKα信号轴促进少突胶质细胞发育和髓鞘化的功能,为叶酸在神经系统中的作用研究提供了理论依据,同时也丰富了少突胶质细胞的调控因子网络,为临床上脱髓鞘疾病的治疗拓宽了视野和方向。