目的 骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)能同时表达内胚层、中胚层和外胚层等所有三个胚层的基因，具有向其它细胞和组织多向分化的潜能。除了能向骨组织、软骨组织、神经组织、肌肉组织、脂肪组织等分化外，现已初步发现在创伤条件下MSCs能分化成肉芽组织中的血管内皮细胞以及表皮细胞参与创伤修复过程，但其机制尚不明确。同时，作为成体来源的干细胞，MSCs取材方便，体外易于分离和扩增，培养方法较简单。因此，近年来MSCs在生物组织工程和创伤修复的研究中占据了重要位置。由于MSCs具有多向分化的干细胞特征，回输体内后可定位于骨髓并通过自我更新而长期存活，而且逆转录病毒介导的多种外源目的基因可整合至MSCs基因组DNA中并能长期表达，因此，MSCs作为一种理想的靶细胞可用于基因治疗。 烧伤血清是一种具有多种活性成分的复合物，其成分在一定的时间内随伤后的时间而变化。烧伤后血清成分的改变包括补体、黏附分子和白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素等细胞因子在伤后不同时间的动态变化。可能还有一些未知的因子发生改变，并可能影响MSCs的基因表达。将烧伤大鼠血清加入MSCs培养体系，能部分模拟烧伤后的体内环境，烧伤血清中含有的因子可能是诱导MSCs表型改变的原因。 本研究基于以上基础研究与临床观察提出的生物学问题，希望利用MSCs体外易于分离和扩增，培养方法较简单的特点，采用细胞培养、免疫细胞化学、流式细胞仪和基因芯片等技术方法，从细胞生物学、基因表达等方面观察烧伤血清对大鼠MSCs的影响，并探讨这些影响与烧伤的关系，以期为研究其参与创伤修复军医进修学沈硕士学位论久中文摘要的机制提供依据，为将来采用少量干细胞快速增殖用于烧创伤创面修复，最终为烧创伤创面的解剖与功能完全修复提供理论基础。 方法将大鼠致巧%TBSAlll度烧伤，并于伤后不同时间采血，分离血清备用。同时采集正常大鼠血清。无菌条件下用密度梯度离心法分离大鼠MSCS，在37℃、5%CO:及饱和湿度条件下培养，正常换液、传代。向已经纯化的MSCS培养体系中加入烧伤大鼠血清和正常大鼠血清，用MTT法测定其OD值并描绘其生长曲线，PI染色，流式细胞仪分析细胞周期、DNA含量和细胞凋亡率。 用免疫细胞化学染色法和流式细胞仪技术检测MSCS内cK一P和vlll因子(FVllj)相关抗原的表达。免疫细胞化学染色采用两步法，具体操作按试剂盒说明书进行。同时设不加一抗的阴性对照。在光学显微镜下进行组织学观察，以细胞浆CK一P和FV川相关抗原经免疫细胞化学染色呈棕黄色着色为阳性结果。 分别用含有正常大鼠血清和烧伤大鼠血清的F一12培养基培养24h及72h后，TRIzol一步法提取MSCs中的总RNA，用cy3一duTP和cys一dUTP标记提取的mRNA，并逆转录成cDNA。以含有5705种基因的寡核普酸微阵列分别检测两组细胞基因表达的差异。 用STAI人软件和SPSS软件对所有数据进行统计学处理。 结果烧伤大鼠血清处理细胞的生长曲线与含有FCS的F一12培养基传代培养的细胞明显不同。前者倍增时间缩短，且平台期所能达到的细胞总数明显增加。 烧伤大鼠血清处理的细胞中GO/G;期细胞比例明显降低(P<0.01)，而s期细胞的比例则相反(P<0.01)。烧伤大鼠血清处理的细胞中DNA含量明显高于正常大鼠血清处理的细胞(P<0.01)。而烧伤3天大鼠血清处理细胞的凋亡率比其它组细胞明显升高(P车医进修学陇硕士李位论文中久摘要<0 .01)。 烧伤大鼠血清处理的MsCS能同时表达CK一P和Fv川相关抗原，正常大鼠血清和FCS处理的细胞均无阳性表达。经流式细胞仪检测，烧伤大鼠血清处理的MSCS表达CK一P和FVll!相关抗原的阳性率高于其它两组护<0.01)。 烧伤大鼠血清和正常大鼠血清处理不同时间后，两组MSCs对比，均有不同数量的基因表达存在明显差异。大鼠血清处理24小时后，两组相比较有4条基因表达存在明显差异;烧伤血清处理72h后，两组相比较有11条基因表达存在明显差异。两个时间点差异表达的基因无相同基因。 结论实验结果提示，烧伤大鼠血清不仅对大鼠MScS的生物学行为有广泛的影响，而且同时在转录翻译水平上影响了MSCs的基因表达。烧伤大鼠血清刺激MSCS，使其RNA表达发生了改变，且随着烧伤血清处理时间的不同，差异表达的基因也发生动态变化。烧伤大鼠血清还能诱导MSCS同时向血管内皮细胞和表皮细胞分化。 原因可能是烧伤大鼠血清内可能含有多种能影响MSCS生长的物质，且其含量随烧伤的时间变化而改变，对MSCS生长的影响是复杂的。MSCS基因表达的这些改变可能与MSCS受到刺激后参与创面修复有关。