论文部分内容阅读
蛋白磷酸酶PP2A是真核生物中最主要的一种丝氨酸/苏氨酸型磷酸酶,由65kD的结构亚基A,36kD的催化亚基C和54-130kD的调节亚基B组成三聚体全酶行使功能。结构亚基A以PP2A-Aα和PP2A-Aβ2种异构体形式存在,为催化亚基C和调节亚基B提供结合的支架和平台,对维持PP2A的活性起着非常重要的作用。PP2A-Aα和PP2A-Aβ基因突变导致多种不同的癌症及其他人类疾病的产生。本实验小组近期的研究确立了小鼠蛋白磷酸酶PP2A-Aα基因核心启动子的结构和主要调节因子的分析。结果表明PP2A-Aα启动子受多个转录因子调控,其中最主要的是转录因子Ets-1, CREB和AP-2α行使正向调控作用,而转录因子Sp1/Sp3则起着负向调控功能。本论文主要集中对小鼠PP2A-Aβ基因核心启动子的结构和功能进行分析,其研究工作和结果阐述如下：(1)通过5’端删除突变质粒的构建和体外荧光素酶报告基因活性实验结果分析,我们确定小鼠PP2A-Aβ基因核心启动子区为480bp的-430到+50区；(2)运用TFsearch. TESS等在线生物学分析软件对核心启动子区480bp的序列进行分析表明此区域主要存在转录因子Ets-1, Sp1/Sp3和RXRa/β的结合位点；(3)凝胶迁移滞后实验(EMSA)证实转录因子Ets-1, Sp1/Sp3和RXRa/β在体外都能较强的结合到小鼠PP2A-Aβ基因核心启动子上的相应序列；(4)染色质免疫沉降实验(ChIP)证实在活体细胞中各转录因子Ets-1,Sp1/Sp3和RXRα/β能结合到小鼠PP2A-Aβ基因的启动子上；(5)体外定点突变转录因子结合位点和荧光素酶报告基因活性实验初步发现转录因子Ets-1、Spl/Sp3和RXRα/β正向调节PP2A-Aβ基因启动子活性；(6)在αTN4-1细胞中过表达Ets-1,Sp1/Sp3和RXRα/β,然后通过Real-time PCR和Western Blot分别在RNA和蛋白水平进一步证实各转录因子Ets-1、Sp1/Sp3和RXRα/β对内源PP2A-Aβ基因的调节作用。因此,我们的实验结果表明Ets-1,Sp1/Sp3和RXRα/β多个转录因子共同调节小鼠PP2A-Aβ基因的表达。PP2A-Aα和PP2A-Aβ基因启动子上起着不同调控作用的不同转录因子结合位点的存在,为PP2A-Aα和PP2A-Aβ基因显著的差异表达提供了理论依据。