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棉花纤维是纺织工业的重要原料,在国民经济中占有重要地位。纤维的发育从胚珠表皮细胞的分化和突起开始,并决定纤维的最终品质和产量。因此从分子水平阐明棉纤维初始发育的机理以及影响纤维品质和产量的主要因素,具有重要的理论价值与现实意义。本研究选用3个无绒无絮突变体(xZ142 FLM、 MD17、 SL1-7-1)、2个无绒有絮突变体(N1N1、 n2n2)和超短纤维突变体(Li1li1)进行棉花纤维初始发育和伸长发育早期转录因子的表达分析,并和叶片表皮毛发育的转录因子进行比较,克隆1个负向调控的R3-MYB基因GhCPC和1个与细胞骨架相关的基因GhDIS2,初步阐述该基因的功能。1、棉花纤维和叶片转录因子的表达分析转录因子也称为反式作用因子,是指能够与真核基因的顺式作用元件发生特异性相互作用并对转录有激活或抑制作用的DNA结合蛋白。本研究对棉属编码GL1、GL2、GL3、WD40的转录因子进行表达分析。这些转录因子包括了编码WD40的GhTTG1、 GhTTG2, GATTG3, GhTTG4,编码GL2的GhDEL61 GhDEL65,编码GL3的GhHOXl、 GMOX2、 GMOX3,编码GL1的GMYB2, GhMYB25, GAMYB109及其他MYB基因。扫描电镜观察突变体1 DPA胚珠表面,无绒无絮突变体表面光滑无突起细胞,2个无绒有絮突变体的纤维突起数量明显少于野生型。从野生型和无绒无絮突变体的-3、0、1 DPA胚珠的差异表达分析发现,GhTTG1、GhTTG3、GhDEL61、 GhDEL65, GhMYB25等转录因子在不同时期的有纤维材料中优势表达。从野生型和无绒有絮突变体的1、3、5 DPA胚珠和纤维混合物的基因差异表达分析发现,GhTTG3, GhTTG4、GhDEL61、GhMYB38等多个基因在无绒有絮突变体中低表达。超短纤维突变体(Li1li,)表现为纤维伸长停止,是研究纤维伸长发育早期的优异种质资源。从野生型和超短纤维突变体的差异表达分析发现,GhTTG1、GhDEL61、GhDEL65、GMYB25、 GhMYB38、 G042C02A等转录因子在4 DPA野生纤维材料中优势表达。其中,G042C02A是本实验室7235 cDNA文库中一个克隆,是新的棉属转录因子。扫描电镜观察陆地棉遗传标准系TM-1和密生绒毛品系T586功能叶正面,T586叶正表面密布绒毛,而TM-1叶表面仅有球状突起。选用这两个材料分析转录因子在成熟叶片中的差异表达,GhMYB25、 GhDEL61在T586中高表达。2、棉纤维发育负向调控因子GhCPC的克隆与鉴定MYB转录因子是植物转录因子家族中最大的家族之一,有着广泛的生理功能,几乎参与植物发育和代谢的各个方面。在模式植物拟南芥(Arabidopsis)中,已克隆多个MYB转录因子,并鉴定其和表皮毛(Trichome)发育相关。CPC是表皮毛发育的负向调控因子,和bHLH竞争性结合,并抑制叶片表皮毛发育。本研究从TM-1开花当天胚珠中克隆棉花CAPRICE(CPC)基因cDNA全长,包含240bp的ORF,编码79个氨基酸,包含典型的R3-MYB基序。克隆GhCPC在棉花突变体材料中的不同拷贝,分析了核苷酸和推导的氨基酸序列差异。基因组序列分析推测陆地棉的CPC基因可能来自G. herbaceum (A-genome),基因组序列平均每73 bp一个SNP突变。基因表达分析发现,CPC基因在陆地棉TM-1不同时期的胚珠或纤维、根、叶中均有表达,表达最高值出现在3 DPA的纤维,TM-1的茎不表达。分析该基因在不同突变体中的差异表达发现,0.1,3 DPA, TM-1中的表达量明显低于无绒无絮和无绒有絮突变体的表达；TM-1叶片中的表达量明显高于密生绒毛品系T586中的表达；在RIL纯系中,有绒有絮纯系的平均值显著低于无绒有絮纯系和无绒无絮纯系。单标记分析,CPC基因和纤维表型性状是相关的。TAIL-PCR克隆CPC基因的启动子,陆地棉和G. herbaceum的CPC基因启动子包含GARE-motif,而G. ramondii没有。瞬时转化上述两种启动子,证明其都有转录活性。CPC基因转化离体培养的胚珠,显著抑制纤维的生长,并受到GA3的影响。由此推测,CPC基因是棉花纤维发育的负向调控因子。3、棉花GhDIS2基因的克隆与初步功能分析转录因子随核细胞骨架运输到调控位点,细胞骨架的形成和解聚影响转录因子的调控。拟南芥DISTORTED2(DIS2)编码ARP2／3复合体的ARPC2亚基。dis2突变表现表皮层肌动蛋白成斑状、微管在成簇的肌动蛋白附近异常聚集等。运用同源候选基因法从开花当天野生型胚珠中克隆棉花GhDIS2,该基因包括完整的975 bp的ORF,编码324个氨基酸。表达分析发现,它在陆地棉TM-1不同来源的组织中均表达,于开花后12 d达到表达高峰,开花后18 d表达开始下降,根和茎的表达量较低。在四倍体棉花基因组中存在2个拷贝。转化裂殖酵母,使该基因在真核细胞中表达,GhDIS2促使细胞扩大。初步推测,GhDIS2和其他植物的DIS功能相似,在细胞骨架的形成和解聚过程中起作用.