龙眼（Dimocarpus longan）是药食同源生物资源,在我国民间和中医常以龙眼果肉入药,治疗多种病症,但其物质基础和机制尚不明确。现代营养学发现龙眼多糖（longan pulp polysaccharides,LP）是龙眼果肉的主要功能物质,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、提高机体免疫等活性。但是多糖不能被人体直接吸收。肠道微生物酵解、利用,短链脂肪酸产生,被认为是功能多糖发挥生理活性的主要方式。本研究旨在探究龙眼果肉多糖对肠道粘膜免疫的调节作用及其机制。1.龙眼果肉多糖的超高压-酶法提取工艺优化采用Box-Benhnken中心组合试验设计优化龙眼干果肉水溶性多糖的超高压-酶法提取工艺,建立五因素回归模型,确定其最优提取工艺条件,此时龙眼果肉多糖提取率为8.55±0.42%。相比于热水提取法、酶解提取法、超高压提取法,超高压-酶解提取法可显著提高龙眼果肉多糖提取率和乙酰胆碱酯酶抑制率,多糖中糖醛酸比例显著增加,但并未对糖链的基本结构产生影响。2.龙眼果肉多糖体外消化酵解模拟在模拟胃、小肠消化过程中,龙眼果肉多糖相对分子质量逐渐降低,消化液中还原糖含量增加,此过程中均无游离单糖产生。进一步采用人体粪便菌群模拟龙眼果肉多糖的人体结肠酵解情况发现,龙眼果肉多糖经体外人体粪便菌群酵解48 h后,酵解液中菌群数量显著增加（P＜0.05）;总糖含量和p H显著降低（P＜0.05）;多糖相对分子量降低;阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶的酶活显著提高（P＜0.05）,主要代谢产物短链脂肪酸总量提高了4.22倍,其中乙酸、丙酸和丁酸含量均显著增加（P＜0.05）。由此表明:经胃、小肠、结肠消化后,龙眼果肉多糖分子量逐步降低,且能够被肠道菌群利用,主要产生乙酸、丙酸和丁酸。3.龙眼果肉多糖调节肠道免疫功能及其机制研究以龙眼果肉多糖为材料,环磷酰胺处理小鼠为免疫抑制模型,将不同剂量龙眼果肉多糖溶液（100、200、400mg/kg）灌胃28d后,采用RT-PCR及Western blot分析小肠中调节Ig A合成相关基因的m RNA及相应蛋白表达情况;分析紧密连接、粘液层形成相关基因表达情况,探究LP对免疫抑制小鼠肠道免疫屏障的调节作用。同时,通过分析体重变化;脾脏、胸腺指数;血清细胞因子和免疫球蛋白的水平,明确龙眼果肉多糖的整体免疫调节作用。结果表明,LP能通过增加CD40、TGF-β表达促进Ig A+浆母细胞的转化,调节CCL25、CCL28、CCR9和CCR10的表达促进Ig A+浆母细胞的归巢,增加小肠中Ig A、J-chain、secretory component（SC）的m RNA及相应蛋白表达,促进肠粘膜上皮细胞向肠黏液中分泌S-Ig A和粘液素mucin 2,发挥免疫调节作用。龙眼果肉多糖可以增加紧密连接蛋白ZO-1、claudin-1、claudin-4和粘附蛋白E-cadherin的m RNA及相应蛋白表达,改善环磷酰胺导致的肠绒毛受损情况。此外,龙眼果肉多糖能够改善环磷酰胺导致的胸腺、脾脏指数下降,升高血液中Ig A、Ig G和Ig M的水平,调节血液循环中TNF-α、IL-1β、IL-10等细胞因子来发挥调节整体免疫作用。4.龙眼果肉多糖对肠道菌群的影响及其与免疫调节活性的关系除对环磷酰胺免疫抑制小鼠的肠道粘膜免疫及肠道屏障评价外,进一研究了龙眼果肉多糖对肠道菌群及其酵解产物的影响。采用GC及16s-r RNA检测对小鼠结肠中粪便内容物进行SCFA水平及分析其菌群分布及丰度差异;采用ELISA分析粪便中相关糖苷酶酶活水平,采用RT-PCR及Western blot对结肠组织中SCFA相关受体GPR41、GPR43及紧密连接蛋白的m RNA及相应蛋白表达进行分析,以此表征龙眼果肉多糖对肠道菌群调节及肠道屏障的保护作用。结果表明,龙眼果肉多糖可以改善环磷酰胺造成的结肠组织紧密连接蛋白ZO-1及粘附蛋白E-cadherin水平下降,保护肠道屏障组织完整性;龙眼果肉多糖能够提高乙酸、正丁酸含量,且其相应受体GPR41、GPR43表达量均有提高,其相关糖苷酶酶活也显著提高,表明龙眼果肉多糖在结肠中被微生物利用,并提高了代谢产物乙酸、丁酸含量。16s r RNA结果表明,相较于环磷酰胺组,龙眼果肉多糖可以提高小鼠粪便中微生物群落的丰富度及多样性,但并未改变菌群的均匀度;通过PCA分析发现,龙眼果肉多糖处理组与正常组及模型组分布有显著差异,且龙眼果肉多糖含量越高,样本间聚集情况更集中,与模型组的差异更大。在菌种组成门水平上,与正常组相比,环磷酰胺提高了小鼠的拟杆菌门水平,降低了厚壁菌门水平,而龙眼果肉多糖处理后,可以基本恢复二者的正常水平。在属水平上,与模型组相比,龙眼果肉多糖提高了Ruminococcus＿1和Prevotellaceae＿NK3B31＿group水平。拟杆菌对于是降解多糖产生SCFA的重要菌群,本研究结果显示,在降解龙眼果肉多糖中,拟杆菌中Prevotellaceae＿NK3B31＿group相较于Bacteroides是起主要作用的菌群。5.龙眼果肉多糖亚级分分离制备、结构鉴定及其对体外免疫及肠粘膜屏障的影响龙眼果肉多糖依次经DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂和Hi Prep Sephacryl S-200HR丙烯葡聚糖凝胶分离纯化后得到4个级分LPⅠa、LPⅡa、LPⅢa和LPⅣa。这4个级分的分子量分布采用超高效聚合物色谱系统（APC）进行检测,表明其相对分子质量（Mw）分别为67.8 k Da、120.2 k Da、4.3 k Da和14.8 k Da,多分散性分别为2.17、1.32、4.46和2.98。通过GC-MS测定其单糖组成,结果表明:LPIa和LPIIa主要由半乳糖和阿拉伯糖组成;LPIIIa和LPIVa主要由阿拉伯糖、半乳糖和鼠李糖组成。红外光谱特征吸收峰可知,4个级分均为含有β-吡喃糖环结构的酸性多糖。结合质谱、红外光谱和核磁共振波谱(~1H NMR、13C NMR、dept135、COSY、HSQC、NOESY、HSQC-TOCSY、HMBC)等结果,推测出LPIIa的糖链精细结构。四个多糖级分均能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中细胞因子TNF-α、IL-6和Caco-2细胞中细胞因子IL-8水平的下降,其中LPIa和LPIIa效果优于LPIIIa和LPIVa。进一步实验发现,LPIa和LPIIa主要通过降低TLR4表达,减少核内NF-κB活化,降低炎症因子水平,从而实现提高紧密连接蛋白表达。LPIa和LPIIa的体外抗炎活性显著优于LPIIIa和LPIVa,可能是由于前者的相对分子量更大且表面疏松,更易与免疫细胞受体结合。本研究探究了机体在胃肠道中对龙眼果肉多糖的可能消化利用过程,从肠道上皮屏障、肠道粘膜免疫及肠道微生物三个角度探讨了龙眼果肉多糖对肠道免疫的调节作用及其机制,为阐释龙眼的免疫调节作用提供科学依据;研究结果对促进龙眼功能食品的开发、促进产业的发展具有重要意义。