研究背景恶性淋巴瘤是原发于淋巴系统的一组疾病,来源于B淋巴细胞,T淋巴细胞或自然杀伤细胞的非正常克隆性增殖,近年来随着AIDS、器官移植、肿瘤放化疗免疫抑制的应用,发病率急剧升高。淋巴瘤主要有霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤两大类,两者有不同的病理和临床表现,其中经典型霍奇金淋巴瘤(classicHodgkin lymphoma,cHL)占HL 95%以上,cHL有着相当独特的病理特征,其恶性成分—H/RS(Hodgkin/Reed-Sternberg,H/RS)细胞只占肿瘤组织的极少部分(＜1%),其余是大量以淋巴细胞为主的背景细胞,背景细胞以T细胞为主,约占70%。H/RS来源B淋巴细胞,有报道其发生与CD99基因表达缺失有关,本课题组前期将慢病毒ShRNA质粒转染内源性mCD99L2(mouse CD99 antigen-like 2)基因表达阳性的鼠B淋巴瘤细胞株A20以筛选低表达mCD99L2基因的mCD99L2~-A20克隆株时发现其中出现类似人cHL的H/RS样细胞(命名LV-mCD99L2~-A20,简称1-1),经过鉴定发现其的确具有H/RS细胞的表型,将A20细胞和mCD99L2~-A20细胞分别接种BALB/c小鼠,A20组皮下成瘤率为75%,而mCD99L2~-A20的皮下成瘤率仅有5%,成瘤率极低,所以构建类人HL动物模型陷入了困境。考虑到cHL为免疫系统恶性肿瘤,其发生与机体免疫缺陷有着密切的关系,此外,H/RS细胞的生存需要特殊的免疫微环境,尤其是背景T淋巴细胞,因此接下来的研究通过改变小鼠的免疫状况来诱导其成瘤。本研究采取了小鼠全身放射的方式,以此来抑制其免疫功能,改变其T细胞亚群分布,达到提高成瘤率的目的,进一步建立类人cHL动物模型打下基础。H/RS细胞的产生同其所诱导的免疫微环境密切相关,报道显示可能有多种细胞因子参与了H/RS细胞在体内的生存、增殖和逃避凋亡的过程。H/RS细胞周围的背景细胞大部分为T细胞,但肿瘤细胞并没有被T细胞杀伤,相反得到了存活,据此推测T淋巴细胞在维持H/RS细胞存活当中起着至关重要的作用,肿瘤细胞同T细胞之间通过某些细胞因子相互作用得以共生,以此营造了H/RS细胞适宜的生存环境。那么究竟背景T细胞与cHL及H/RS细胞之间的关系如何,目前的研究只揭露出冰山一角,相关的文献报道比较少,研究方法也很局限,所以两者具体的相互作用机制至今尚未明确。本研究首先通过改变T细胞亚群成功诱导课题组前期构建的类人H/RS细胞—mCD99L2~-A20细胞BALB/c鼠成瘤,接下来采取了体外模拟H/RS细胞的微环境的方式利用前期课题组构建的类人H/RS细胞株mCD99L2~-A20细胞同其同源的BALB/c小鼠胸腺细胞以及脾脏细胞共同培养,初步探索H/RS细胞同周围背景T细胞之间的关系。此外,为进一步明确肿瘤细胞同微环境中T细胞的相互作用机制,本研究还借助了生物信息学方法,以期从大量的生物信息中探索H/RS细胞同背景T细胞相互作用的网络关系。目的1.通过放射的方式改变BALB/c鼠体内T细胞亚型分布,促进mCD99L2~-A20类人H/RS细胞株成瘤,为进一步构建类人cHL动物模型打下基础。2.mCD99L2~-A20细胞同BALB/c小鼠胸腺细胞以及脾脏细胞共同培养在体外模拟H/RS细胞与T淋巴细胞共生的微环境,探究T细胞与mCD99L2~-A20细胞之间的关系并观察两者共培养对体内成瘤的影响。3.借助生物信息学方法利用公共芯片数据资源以及相关软件进行分析,比较H/RS细胞同B淋巴瘤细胞基因芯片表达数据差异,探究同H/RS细胞周围背景T淋巴细胞产生关系密切的细胞因子和趋化因子,进一步阐明cHL微环境形成的机制。方法1.改变T细胞亚群诱导mCD99L2~-A20细胞BALB/c鼠成瘤将低表达mCD99L2基因的mCD99L2~-A20细胞亚系经皮下接种BALB/c小鼠,小鼠在接种前接受2Gy放射,观察动物成瘤时间、成瘤率、皮下肿瘤生长速度;取瘤组织做HE染色观察病理学形态;肿瘤组织进行原代培养,肿瘤组织细胞悬液流式细胞仪检测mCD30抗原表达;DNA-PCR检测载体的整合;流式细胞仪检测小鼠外周血CD3、CD4、CD8的比例。2.mCD99L2~-A20细胞与T淋巴细胞共同培养的研究mCD99L2~-A20类人H/RS细胞同BALB/c小鼠胸腺细胞以及脾脏细胞共同培养,倒置显微镜观察共培养后肿瘤细胞同淋巴细胞的形态;流式细胞仪检测共培养细胞CD4、CD8、CD25抗原表达;培基中加入IL-2(interleukin-2)和TNF(tumor necrosis factor)两种细胞因子,检测淋巴细胞转化能力;共培养细胞接种BALB/c小鼠皮下,观察其成瘤情况,取脏器做HE染色切片观察病理学形态;流式细胞仪检测小鼠外周血CD4、CD8、CD25的比例;ELISA检测共培养细胞上清液中IFN-γ(IFN-gamma)和IL-10(interleukin-10)的表达。3.芯片数据探究H/RS细胞同T细胞关系与mCD99L2~-A20蛋白芯片比较分析以B淋巴瘤细胞作为对照,利用GeneSifter在线软件和BRB-Array Tools对公共基因芯片数据库GEO中的H/RS细胞以及B淋巴瘤细胞基因芯片表达数据进行差异统计学分析,并对这些差异基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)通道分析;生物学过程分析;STRING 8.0在线分析细胞因子相关差异基因表达蛋白网络关系,并同前期课题组完成的mCD99L2~-A20细胞和mCD99L2~-A20成瘤组织蛋白芯片差异比对;PubMed数据库对筛选出的差异基因进行文献挖掘,对差异细胞因子进行初步分析。4.本课题所用统计学方法采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差((?)±s)表示。两组成瘤率的比较采用两个独立样本χ~2检验;两组成瘤时间的比较采用两样本t检验;在体肿瘤生长曲线的比较采用重复测量方差分析方法处理,若球形检验P＜0.05,拒绝球形检验,用Greenhouse-Geisser进行校正,采用校正后的F值和P值;流式细胞仪检测血淋巴细胞亚群比例数据采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组差异,两组间比较采用LSD多重比较法;两组胸腺重量的比较采用两样本t检验;IL-2和TNF刺激淋巴细胞转化实验结果数据采用单因素方差分析比较各组差异,两组间比较采用LSD多重比较法;ELISA检测共培养细胞上清液IFN-γ和IL-10在48h,60h和5d三个时间点实验组和对照组的差异,实验结果数据采用析因设计的方差分析。结果1.改变T细胞亚群诱导mCD99L2~-A20细胞BALB/c鼠成瘤(1) mCD99L2~-A20接种后成瘤情况:皮下接种2×10~7细胞于20只放射后BALB/c小鼠(20个位点),成瘤率65%,较未处理组(5%)明显提高,差异具有显著性(P=0.000),平均成瘤时间为6.54±0.88天,较接种A20组成瘤时间缩短,差异具有显著性(P=0.000),生长速度也较A20组快,差异具有显著性(P=0.000)。(2)病理形态:放射后BALB/c小鼠成瘤组织光镜观察瘤细胞大小不一,弥漫分布,可见散在的胞浆丰富的大细胞,呈双核、多核或不规则核,核仁大,类似人HL的H/RS细胞形态。(3)放射后BALB/c小鼠瘤组织原代培养,肿瘤组织细胞悬液流式细胞仪检测mCD30比例为60.2%;(4) DNA-PCR检测mCD99L2干扰载体整合在细胞基因组。(5)流式细胞仪检测小鼠外周血淋巴细胞亚群:各组间CD3、CD4阳性细胞比例无显著差异。统计分析显示各组间CD3~+细胞比例差异无显著性(P=0.116),各组间CD4~+细胞比例差异无显著性(P=0.104),CD8~+细胞比例存在显著性差异(P=0.000),放射后接种mCD99L2~-A20细胞成瘤BALB/c小鼠与正常BALB/c小鼠以及未成瘤BALB/c小鼠相比外周血CD8~+细胞比例明显降低(P=0.000,P=0.001)。2.mCD99L2~-A20细胞与T淋巴细胞共同培养的研究(1)共培养过程中倒置显微镜观察:共培养48h后胸腺细胞+mCD99L2~-A20组可见淋巴细胞环绕着肿瘤细胞呈花环状生长;胸腺细胞+mCD99L2~-A20+IL-2组48h和72h分别观察发现随着共培养时间的延长,瘤细胞死亡数目逐渐增多,而对照组胸腺细胞+A20+IL-2组此种现象不明显。(2)流式细胞仪检测共培养1w后细胞CD4~+CD25~+Treg细胞和CD8~+细胞比例:胸腺/脾细胞+mCD99L2~-A20组CD4~+CD25~+Treg细胞比例(7.8%/8.5%)要明显高于胸腺/脾细胞+A20组(1.1%/1.6%);胸腺细胞+mCD99L2~-A20+IL-2组CD8~+细胞比例(72.0%)要高于不加IL-2组(68.0%),同时也明显高于胸腺细胞+A20+IL-2组(57.8%)。(3)淋巴细胞转化实验:胸腺细胞+mCD99L2~-A20+IL-2共培养组淋巴细胞转化能力要强于缺乏IL-2组,差异有显著性(P=0.037),反之,胸腺细胞+mCD99L2~-A20+TNF共培养组淋巴细胞转化能力要弱于缺乏TNF组,差异有显著性(P=0.044)。(4)动物皮下接种共培养细胞成瘤实验:胸腺细胞+mCD99L2~-A20(实验组)和胸腺细胞+A20(对照组)共培养1w后分别皮下接种BALB/c鼠,每组3只,2周后实验组均未成瘤,对照组3只均成瘤;胸腺细胞+mCD99L2~-A20/A20+IL-2(实验组/对照组)共培养24h后分别接种3只BALB/c鼠,6只均未成瘤,分别取胸腺观察,实验组胸腺的体积小于对照组,重量也小于对照组,差异具有显著性(P=0.017),HE染色切片观察到实验组胸腺细胞稀疏,对照组胸腺细胞较正常,细胞排列密集。(5)流式细胞仪检测接受过共培养细胞皮下注射的BALB/c鼠血:接种后2周检测鼠血液CD4、CD25和CD8的表达,胸腺细胞+mCD99L2~-A20组CD4~+CD25~+Treg细胞和CD8~+细胞比例(分别为3.3%和8.9%)均高于单独接种mCD99L2~-A20组(分别为3.1%和5.2%)。(6)共培养上清检测IFN-γ和IL-10:胸腺细胞+mCD99L2~-A20共培养组(实验组)和胸腺细胞+A20共培养组(对照组)上清液分别在共培养24h、60h和5d检测IFN-γ和IL-10,共培养24h和60h对照组表达较高IFN-γ,差异具有显著性(P=0.001,P=0.001),24h和60h时对照组表达较高的IL-10,差异具有显著性(P=0.000,P=0.000),5d时实验组表达较高的IFN-γ和IL-10,差异具有显著性(P=0.047,P=0.020)。以上结果表明随着共培养时间的延长,实验组Th1细胞分泌了较多的IFN-γ,Th2细胞分泌了较多IL-10。3.芯片数据探究H/RS细胞同T细胞关系与mCD99L2~-A20蛋白芯片比较分析(1)对基因表达谱数据GSE8388分析得出cHL细胞株L428和B细胞淋巴瘤细胞株Raji之间差异表达基因KEGG通路分析显示细胞因子和细胞因子受体相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)通道和JAK酪氨酸激酶和信号转导子和转录活化子(JAK-STAT)通道是差异最显著的两条通道;免疫生物过程差异表达基因谱分析显示在差异最显著的15个基因中发现了CCL5、CCL22、CCL17和IL-6四个因子,它们同cHL H/RS细胞募集T细胞关系密切,它们的表达均比B细胞淋巴瘤高;差异基因生物学过程分析显示在T细胞激活以及细胞因子合成过程中IL-6均发挥了显著的作用。(2)对基因表达谱数据GSE12453分析得出cHL瘤组织细胞和弥漫大B细胞淋巴瘤组织细胞之间的差异显著的基因302个,cHL组织细胞和正常淋巴细胞之间的差异显著的基因,共363个,两组差异表达基因交叉比较得出cHL相对于B细胞淋巴瘤发病过程相关的特有基因共48个,其中上调6个,下调42个,包括一种上调的细胞因子,IL-16。(3)利用STRING 8.0在线分析平台对GSE12453分析得出的cHL组和B细胞淋巴瘤DLBCL组差异基因中最显著的14个细胞因子相关基因进行蛋白功能关系分析,并同前期课题组所做mCD99L2~-A20细胞和mCD99L2~-A20成瘤组织蛋白芯片差异比对,筛选出了同H/RS细背景T细胞产生关系最密切的六种细胞因子以及趋化因子,包括RANTES、MIG、CCL22、CCL17、IL-6以及CXCL16,其中MIG处于它们相互作用的中心位置。结论1.类人H/RS样细胞—mCD99L2~-A20细胞在正常BALB/c鼠成瘤率极低,经放射免疫抑制T细胞后得到很大的提高,提示了机体的免疫功能下降以及T淋巴细胞亚型分布发生了改变,细胞毒性T细胞减少和辅助性T淋巴细胞相对增多,有利于介导H/RS细胞T细胞微环境的形成,促进瘤体的形成。2.通过体外模拟H/RS细胞生存的微环境得出H/RS样细胞—mCD99L2~-A20细胞可以募集大量的CD4~+CD25~+Treg细胞,以此来介导免疫耐受,同时抑制CD4~+Th1和CD8~+CTL对其杀伤作用,Th1、Th2以及CTL可通过IL-2、TNF、IFN-γ和IL-10等一些细胞因子同肿瘤细胞发生相互作用,维持肿瘤细胞内环境的稳态。3.借助生物信息学方法利用公共芯片数据资源以及相关软件分析HL产生过程中H/RS同背景T细胞相互作用的关系密切的细胞因子和趋化因子有RANTES、MIG、CCL22、CCL17、CXCL16、IL-6、IL-16等,本课题组构建类人mCD99L2~-A20细胞模型及BALB/c小鼠体内成瘤较类似人cHL。