背景和目的 因头颈部肿瘤放射治疗后损伤涎腺及舍格伦综合征引起的口干临床上很常见。目前尚无良好的预防和干预措施，只能通过刺激残留腺泡细胞促进唾液分泌，缓解口干症状。对于腺体组织受损严重的患者目前尚无治疗方法。在放射损伤涎腺造成唾液分泌减少的动物模型上，通过腺病毒，腺病毒相关病毒介导人水通道蛋白1基因(HumanAquaporin 1，hAQP1)转染涎腺残留细胞，可部分恢复涎腺唾液分泌功能，起到一定的治疗作用。转导水通道基因只是改变细胞透水性，变非分泌导管上皮组织为具有分泌功能的涎腺细胞。但唾液分泌是由电解质介导的主动转运过程，仅有水通道没有电解质主导，其分泌作用有限。对于腺体组织被完全破坏的病人上述单基因治疗的方法则无法发挥作用，只能选择组织工程人造涎腺的方法来治疗。 本研究通过构建能介导人钠钾氯离子协同转运体1(Human Na<+>-K<+>-2Cl<->Cotransporter 1，hNKCC1)基因的重组腺病毒，转染体外原代培养的人颌下腺细胞(}tuSMG)和恒河猴腮腺细胞(RPG)，重建其分泌电解质的功能，同时利用腺病毒介导人水通道蛋白1基因重建原代培养细胞对水的通透性，达到重建细胞分泌唾液功能的目的。 材料与方法 通过限制性内切酶酶切携带hNKCClcDNA的质粒Bluescript和穿梭质粒pACMV-pLpA，得到目的基因片断hNKCCl和穿梭质粒载体片断，连接酶连接构建携带hNKCCl的穿梭质粒pCMVhNKCCl。转化感受态大肠杆菌，挑选能表达pCMVhNKCCl的细菌克隆，扩增，纯化质粒，并用酶切方法鉴定pCMVhNKCCl是否正确构建。Western Blot蛋白印迹法和铷86同位素流量分析法鉴定pCMVhNKCCl能否正确表达hNKCCl蛋白，并正确行使转运离子的功能。将携带hNKCCl的穿梭质粒pCMVhNKCCl和骨架质粒pJM17用磷酸钙沉淀法共转染293细胞，在细胞内同源重组制造和装配能转导hNKCCl的血清型5的复制缺陷重组腺病毒rAd5hNKCCl。当看到293细胞被腺病毒溶解破坏(Cytopathic Effects，CPE)时，收获所有细胞。将细胞悬液干冰冰冻，37度融解，振荡5次裂解细胞制造病毒溶菌液CVL(crude viral lysate)。梯度稀释CVL至10<-17>，使用10<-6>至10<-17>稀释液转染293细胞，覆盖1X MEM琼脂糖凝胶固体培养基，观察10-12天，待腺病毒破坏溶解细胞形成空斑，挑选腺病毒单克隆。转染293细胞24小时后，制备hNKCCl膜蛋白样本，Western Blot蛋白印迹法鉴定选取表达hNKCCl蛋白最强的AdhNKCCl克隆。293细胞内扩增病毒，氯化铯密度梯度离心方法纯化病毒。定量PCR测量AdhNKCCl滴度。 来源于头颈部肿瘤病人术后的正常颌下腺组织和恒河猴腮腺组织机械方法切碎，胰酶和胶原酶消化，无血清Hepatocyte培养液培养获得人颌下腺原代培养细胞(HuSMG)和恒河猴腮腺原代培养细胞(RPG)。用不同剂量AdhNKCCl转染A5，MDCK Ⅱ，HSG，人颌下腺原代培养细胞(HuSMG)和恒河猴腮腺原代培养细胞(RPG)，观察不同剂量病毒在不同种细胞内表达hNKCCl蛋白的功能活性情况。免疫荧光染色培养在滤膜上的MDCK Ⅱ细胞和RPG细胞，激光共聚焦显微镜观察hNKCCl膜蛋白在极性细胞上的分布。将HuSMG和RPG接种在聚酯滤膜上，形成单层极性上皮。测量细胞数量，AdShAQPl以MOI=500(500个病毒颗粒转染一个细胞)的比例，AdhNKCCl以MOI=1000的比例分别和联合转染HuSMG和RPG细胞，转染MOI=1500的空腺病毒作为对照。测量跨上皮细胞电阻，评估细胞是否形成连续单层极性细胞。高渗和等渗的渗透梯度条件下测量液体在15分钟内跨上皮的移动量。等渗条件下，用1μM Thapsigargin处理细胞提高细胞内Ca<2+>测量液体在15分钟内跨上皮的移动量。 结果 酶切、Western Blot蛋白印迹法和铷86同位素流量分析法鉴定成功构建穿梭质粒pCMVhNKCC1。Western Blot蛋白印迹法和铷86同位素流量分析法鉴定成功构建rAd5hNKCC1，并正确行使转运离子功能。AdhNKCC1以MOI=100和1000的剂量转染HuSMG和RPG都表达功能活性，但不同剂量间无差别。免疫荧光共聚焦成像发现适量腺病毒转染极性细胞，正确表达hNKCC1蛋白于细胞的基底膜和侧膜上，大剂量病毒过量表达hNKCC1蛋白时，则分布在整个细胞膜上。AdhAQP1单独或与AdhNKCC1共同转染形成单层极性上皮的MDCKⅡ，HuSMG和RPG细胞24小时后，15分钟内高渗条件下，AdhAQP1组和AdhAQP1与AdhNKCC1共同转染组液体移动量显著高于转染对照病毒组和单独转染AdhNKCC1组，但前两者间无显著性差异。等渗条件下各组都基本不产生液体移动。等渗条件下细胞用1μM Thapsigargin处理后AdhAQP1和AdhNKCC1共同转染组液体移动量高于AdhAQP1单独转染组，有显著性差异；此条件下AdhAQP1组与AdhAQP1和AdhNKCC1共同转染组液体移动量均高于转染对照病毒组和单独转染AdhNKCC1组。 结论 成功构建AdhNKCC1重组腺病毒，体外实验发现其能表达hNKCC1蛋白于极性细胞基底膜和侧膜上，并正确行使转运离子功能，为进一步利用介导hNKCC1基因治疗唾液分泌减少的动物实验和临床实验打下基础。并为研究hNKCC1蛋白生理功能提供了基础。 体外AdhAQP1和AdhNKCC1联合转染涎腺原代培养细胞能重新构建其分泌水和电解质的功能，分泌效果优于单纯转染AdhAQP1。有望通过联合应用AdhAQP1和AdhNKCC1治疗涎腺腺实质放射损伤引起的口腔干燥。