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鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)属于细小病毒科成员之一,能够引起雏鹅和雏番鸭发病,并以小肠粘膜表层坏死脱落能形成小肠栓塞为主要特征。自2015年以来,国内不断有报道称樱桃谷鸭、北京鸭爆发了一种以短喙长舌为特征性症状的疾病(Duck Beak Atrophy and Dyndrome Syndrome,BADS)。经Chen等人的分离鉴定,确定为新的鸭源鹅细小病毒(Novel Goose Parvovirus,NGPV),本研究的目的是建立检测新型鸭源鹅细小病毒(NGPV)的半套式PCR方法,用该方法对山东、江苏两地进行了NGPV的流行情况调查的,并对分离的其中2株NGPV进行全基因组测序及同源性和进化树的分析。1.山东、江苏两地送检病料的初步检测根据Gene Bank已公布的GPV数据,用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件设计了GPV的PCR检测引物。对山东、江苏两地8个发病鸭群120只发病鸭分别提取心、肝、脾、肺、肾、胸腺、法氏囊、胰腺、脑、胆汁10个脏器组织DNA,共计1200个样进行初步的PCR检测,对引物的特异性进行分析,并统计每个鸭群及各个内脏的检出率。结果显示用该方法检测,每个群的最高检出率为86.7%,最低检出率为66.7%,平均检出率为75.8%,除了脑没检出病毒核酸外,其他脏器中病毒核酸检出率最高为肝脏(62.6%),最低为肺脏(9.9%),平均检出率为34.5%。2.检测新型鸭源鹅细小病毒半套式PCR方法的建立与应用根据Gene Bank已公布的12株GPV、2株NGPV的序列比对结果,用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件在检测设计引物的基础上设计了检测NGPV的半套式PCR外侧引物。GPV-A-F和GPV-A-R能扩增出NGPV长度为779bp的目的基因,同时NGPV-B-R与GPV-A-F组合能够扩出NGPV长度为148bp的目的基因,而扩不出小鹅瘟疫苗的目的基因。最佳条件探索结果:当退火温度为58℃,Mg2+浓度为1.5m M(1.5μL),模板加1μL,引物各加1μL(1p M),31个循环时,效率最高。用建立的半套式PCR方法对病料检测,特异性很好,对1型鸭圆环(Du CV-1)、2型鸭圆环病毒(Du CV-2)、鸭瘟病毒(DVE)、大肠杆菌(E.coli)、沙门氏菌(SE)、鸭疫里默氏杆菌(Ra)5种常见鸭病显示阴性,灵敏性好,最低可以检出100拷贝NGPV病毒核酸。应用建立的半套式PCR方法对前面普通PCR检测的样品进行复检,统计每个鸭群和10个内脏共计1200个样的检出率,并与普通PCR方法获得的数据进行比较分析。结果发现用建立的半套式PCR检测,对鹅细小检测阳性的病料进行检测,每个鸭群的最高检出率为93.3%,最低为73.3%,平均为80.8%,除了脑没检出病毒外,其他脏器的检出率最高为肝脏(93.8%),最低检出率为肺脏(23.7%),平均检出率为55.8%,与普通PCR相比明显提高了检出率。流行情况调查表明,山东、江苏2个地方的NGPV感染情况比较严重,应该引起重视。3.SD-01株和SD-02株NGPV的全基因组测序及系统进化分析根据Gene Bank已公布的12株GPV和2株NGPV序列,用DNASTAR.Lasergene.v7.1软件设计了5对扩增NGPV的全基因组序列的引物,对分离的NGPV SD-01和SD-02毒株进行分段扩增并测序,拼接后获得2株NGPV的全基因组序列,并与其他GPV和NGPV全基因组序列进行同源性分析和进化树构建。SD-01和SD-02的全基因组与其他的12株GPV同源性在92.2~97.0%,而与sdlc01和QH15的同源性99.1~99.6%之间,与MDPV-FM的同源性分别为80.9%和81.1%,进化树分析发现2株NGPV属于GPV这一大分支,与sdlc01株和QH15株在同一个小的分支上;对SD-01和SD-02的VP3基因与12株GPV的同源性分析,发现VP3与GDa GPV的同源性最低为93.0%,与82-032v最高为98.3%,SD-01与sdlc01株和QH15株同源性均为99.8%,而与FM株的同源性仅为81.5%;对SD-01和SD-02的VP3编码的氨基酸同源性分析,与FM株的同源性最低分别为91.0%和90.8%,与GDa GPV同源性最低分别为96.6%和96.4%,SD-01与B株、VG321株的同源性最高,均为98.7%,SD-01与NGPV的sdlc01株和QH15株相比同源性分别为100%和99.6%,SD-02和sdlc01和QH15相比分别为99.8%和99.4%。进化树的分析显示,SD-01、SD-02与FM在不同的大分支上,和sdlc01和QH15分布在同一个小分支上,而与传统的GPV毒株相对距离较远。