合成染料通常含有复杂的芳香环结构、品种繁多、难以降解,且多数染料及其代谢中间产物具有致突变性、致癌性和其他毒性,因此染料废水是一种COD浓度高、可生化性差、色度深、碱度大、水质变化大的难处理废水。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶,其底物范围十分广泛,能催化氧化多种有机物,在制浆造纸工业、纺织工业、污染物降解和有机合成等领域具有广泛的应用前景。漆酶可催化降解多种结构的合成染料,可有效用于染料废水的处理。本研究从森林土壤中筛选到两株具有漆酶活性的细菌菌株,并对其进行了鉴定,研究了筛选菌株的漆酶活性并克隆出漆酶基因进行了序列分析,进一步研究了细菌漆酶和固定化之后的漆酶在染料脱色中的应用,包括合成染料和模拟染料废水的脱色。主要研究结果如下:(1)采用Cu2+富集培养结合漆酶底物显色的方法从森林土壤中筛选得到2株具有漆酶活性的细菌菌株,并命名为LC02和LC03,这两株菌可氧化常见的漆酶底物ABTS、丁香醛连氮(SGZ)和2.6-二甲氧基苯酚(DMP)。通过形态学观察、生理生化实验和16S rDNA序列分析的方法对筛选到的菌株进行了鉴定,结果表明菌株LC02和LC03均为直杆状,革兰氏阳性,能产芽孢,16S rDNA序列的Blast结果表明所筛选的菌株与数据库多株Bacillus amyloliquefaciens的同源性均在99%以上,经鉴定所筛选到的两个菌株属于芽孢杆菌属的B.amyloliquefaciens。(2)筛选到的解淀粉芽孢杆菌LC02和LC03的芽孢漆酶在较广的pH范围内均表现出催化活性,催化ABTS、SGZ和DMP的最适pH条件分别在酸性、中性和碱性范围内。在酸性条件下(pH3.0)稳定性较低,在碱性条件下(pH9.0和10.0)具有较好的稳定性。此外芽孢漆酶也具有较好的耐高温能力,催化SGZ的最适温度分别为60℃和70℃,在100℃仍具有催化活性。还原剂半胱氨酸和二硫疏糖醇对芽孢漆酶抑制效果比较明显,而EDTA只有在高浓度下才表现出明显的抑制效果。大多数金属离子对芽孢漆酶活性表现出一定程度的促进作用,Hg2+、Ag+和Mn2+抑制效果比较明显。0.2 mM以上的NaCl对漆酶活性表现出一定的抑制效果,同时芽孢漆酶对低浓度的有机溶剂和表面活性剂也表现出较好的耐受性。芽孢漆酶在碱性、高温等条件下较好的稳定性以及对抑制剂、金属离子和有机溶剂的较好的耐受性表明细菌芽胞漆酶在工业废水处理上具有比真菌漆酶更好的应用前景。(3)采用B.amyloliquefaciens的cotA基因序列设计特异性引物,从筛选到的芽孢杆菌菌株中扩增出芽孢漆酶基因序列全长并提交到GenBank上,通过Blast 比对分析发现各菌株漆酶基因与数据库中相同芽孢杆菌的序列相似性均在98%以上。菌株LCO2和LC03与B.amyloliquefaciens和B.subtilis的漆酶蛋白序列亲缘关系最近。与Arabidopsis thaliana、Streptomyceslavendulae和Streptomyces pristinaespiralis漆酶蛋白序列同源性较高,与其它细菌漆酶和白腐菌漆酶的蛋白序列同源性相对较低。芽孢漆酶蛋白序列芽孢漆酶与其它细菌和真菌漆酶一样具有三个铜离子结合保守结构域,参与Ⅱ型和Ⅲ型铜三核中心形成的8个His以4个高度保守的His-X-His形式出现。利用一系列生物信息学软件对芽孢漆酶蛋白序列进行了分析,结果表明两株菌的芽孢漆酶的氨基酸长度相同,分子量位于58 kDa左右,等电点为6.19,所有芽孢漆酶蛋白序列上均不存在信号肽,有3个疏水区域。菌株LC02和LC03芽孢漆酶基因编码的成熟蛋白的二级结构非常相似,都富含无规则卷曲结构,α-螺旋含量最低。此外在空间三维结构上,两株菌芽孢漆酶基本相似,都由三个结构域组成,近似球形。(4)测试了 B.amyloliquefaciens LC02和LC03的芽孢漆酶对四种结构不同的合成染料RBBR、活性黑、靛红和结晶紫以及这些染料混合组成的模拟染料废水的脱色效果。两种菌株的芽孢漆酶在无介体时仅对结晶紫表现出较好的脱色效果,6 h后脱色率分别为75%和65%左右,对其他三种染料不能脱色。介体的加入能显著提升染料脱色的速率和脱色程度,在所筛选的介体中,乙酰丁香酮(ACE)对所有染料的脱色均表现出较好的促进作用,是所有介体中效果最明显的,靛红在ACE的介导下基本能被完全脱色,RBBR和活性黑在ACE介导下脱色率也可在65%以上。其他介体如紫脲酸(VA)、1-羟基苯并三唑(HBT)和2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)对两种菌株芽孢漆酶的染料脱色没有促进作用。以ACE为介体时在pH9.0的碱性条件下,两菌株的芽孢漆酶对四种染料仍保持了较高的脱色率。ACE与芽孢漆酶组成的漆酶-介体系统能在较广的pH范围内对模拟染料废水有效脱色,在pH3.0时介体对脱色的促进效果不明显,而在其他pH条件下随着介体浓度的增加脱色率显著上升,0.5 mM和1 mM的ACE效果基本相似,在碱性条件下模拟废水的脱色效果最高。pH9.0时,菌株LC02和LC03的漆酶对模拟染料废水的脱色率最高分别为78.34%和73.21%。通过海藻酸钙凝胶包埋的方法实现芽孢漆酶的固定化,并成功用于四种合成染料和模拟染料废水的脱色。固定化漆酶可重复使用4次而脱色能力没有明显下降,对靛红的脱色率仍保持在97%以上(0.1 mM ACE)。此外固定化漆酶在同等条件下对模拟染料废水的脱色效果要高于未经固定化的芽孢漆酶的脱色程度。因此芽孢漆酶对染料脱色较宽广的pH范围以及在碱性条件下较高的稳定性,表明所筛选的B.amyloliquefaciens LC02和LC03的漆酶在工业染料废水的处理中具有非常好的应用前景。