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[研究背景]结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,我国结直肠癌发病率逐年提高。大规模人群普查资料表明,结直肠癌已成为我国发病率位居第四的常见恶性肿瘤。结直肠癌的浸润和转移是治疗失败的主要原因,其中肝脏是最常见的远处转移器官。旦发生肝转移,结直肠癌患者往往预后较差。目前临床上应用的免疫组化标记不能很好的区分高转移风险的患者,因此从分子水平研究结直肠癌肝转移机制,摸清转移规律并从中找到预测和临床治疗靶点从而进行早期干预和治疗成了刻不容缓且意义重大的工作。肿瘤细胞转移是复杂的过程,只有高转移潜能的肿瘤细胞才能最终形成远处转移灶。通过裸鼠原位移植肿瘤可以最好的模拟人体内结直肠癌转移过程,是研究结直肠癌肝转移机制的重要载体。前期研究中,我们课题组通过裸鼠盲肠原位接种法构建了肝转移动物模型,并建立了一株肝转移细胞系SW620M,通过亲代细胞基因表达对比,我们发现肝细胞核因子（HNF6）在SW620M表达升高。并且HNF6的表达在SW620M细胞体外培养一段时间后恢复到原来水平,提示结直肠癌肝转移灶中HNF6的表达与肝脏特异的微环境相关。HNF6属于在肝细胞富集表达的转录因子家族,主要表达与肝脏和胰腺,人类HNF6定位于15q21.1-q21.2,编码465个氨基酸的蛋白质,主要参与胚胎期胰腺形成,肝细胞发育、胆道系统形成、能量代谢等过程。作为基因特异性的转录因子目前已发现HNF6调控NEUROG3, FOXM1、PDX1、HNF1、FOXA1、FOXA2等靶基因的转录。其中多数靶基因为转录因子并已发现参与恶性肿瘤的发生与转移。Prevot PP等发现HNF6在胰腺管状腺癌早期的腺泡-导管化生过程中过表达,提示HNF6与胰腺管状腺癌早期癌变相关。Lehner F等通过免疫组化法对比结直肠癌转移灶与肝转移灶的蛋白表达发现：在肝转移中HNF6和他的靶基因FOXA2、 CXCL1、CXCL2等表达升高。然而HNF6在结直肠癌肿瘤细胞增殖,侵袭转移等过程中的生物功能及机制尚未见报道。本研究旨在通过构建HNF6的慢病毒表达载体,建立慢病毒介导的HNF6过表达细胞系,初步研究HNF6对结肠癌细胞系SW620细胞生物学行为的影响,为下一步机制研究及在结直肠癌肝转移诊断治疗中的应用奠定基础。[研究目的]构建HNF6的重组慢病毒表达载体,生产慢病毒颗粒并建立稳定表达HNF6的结肠癌细胞SW620-HNF6。研究稳定表达HNF6后,SW620细胞形态、迁移能力、增殖能力、克隆形成能力、体内致瘤能力等生物学行为的变化。[研究方法]1.利用pUC57-HNF6为模板,根据Genbank （NM004498.1）中HNF6序列设计引物,经聚合酶链反应（PCR）扩增CDS区利用基因重组技术连接到改造后的穿梭质粒—pLenO-DCE-HA中。2.将pLenO-DCE-HA-HNF6与pRsv-REV, pMD1g-pRRE, pMD2G共转染病毒包装细胞293T收集上清并测定病毒滴度。3.慢病毒颗粒感染SW620细胞建立稳定表达细胞系,western blot （?）去,RT-PCR法检测HNF6表达情况。4.利用荧光显微镜观察细胞形态变化,划痕试验及Transwell法观察细胞迁移能刀。5.绘制细胞生长曲线观察HNF6对SW620细胞增殖能力的影响。平板克隆形成试验观察HNF6对SW620细胞克隆形成能力的影响。6.裸鼠成瘤试验观察稳定表达HNF6后SW620细胞成瘤能力改变。[研究结果]1.经过PCR鉴定、酶切鉴定及测序成功构建了pLenO-DCE-HA-HNF6重组慢病毒表达载体。2.利用293T细胞成功生产高滴度的慢病毒颗粒,滴度为5.1×108TU/ml。3.慢病毒颗粒感染SW620细胞72小时后荧光显微镜观察到较强的GFP表达。经过流式细胞检测到实验组SW620-HNF6与对照组SW620-EGFP的GFP表达率为82.3%和93.8%；细胞免疫组化显示HNF6高表达于细胞核,经过Westernblot检测HA-HNF6融合蛋白表达正确,RT-PCR检测发现mRNA水平上升高明显。4.相差显微镜下观察过表达HNF6后,SW620细胞形态由短梭形变为多边形,失去伪足并且生长更加紧密。Transwell试验显示过表达HNF6后转移细胞数目由72.3±12.9下降到25.0±2.0,具有统计学差异（p<0.05）。划痕试验证明过表达HNF6后细胞迁移能力明显降低。5.生长曲线显示SW620-HNF6细胞增殖能力强于SW620-EGFP细胞,结果从第四天开始有统计学意义（p<0.05）。6.平板克隆形成试验显示SW620-HNF6和SW620-EGFP的克隆数分别为82.33±4.73和53.00±4.00,对应克隆形成率为41.17%和26.5%,具有统计学差异。7.裸鼠成瘤试验显示,注射细胞5周后1×105的SW620-HNF6细胞可成瘤,而对应细胞数的对照细胞不能成瘤。1×106个细胞注射裸鼠24天后,SW620-HNF6细胞形成的肿瘤体积（1808±475.5mm3）明显大于SW620-EGFP（789.9±266.3mm3）结果具有统计学差异（p<0.01）。[结论]我们成功了构建pLenO-DCE-HA-HNF6重组慢病毒表达载体转染293T细胞包装后获得高滴度的慢病毒颗粒。慢病毒可以高效的感染结肠癌SW620细胞并介导HNF6过表达。过表达HNF6可以引起SW620细胞形态改变,并且促进细胞间的粘附,抑制细胞迁移能力；促进SW620细胞体外增殖能力,平板克隆形成能力。HNF6促进SW620细胞的裸鼠致瘤能力及肿瘤生长。