研究背景和目的：　　 多药耐药(multidrug resistance，MDR)细胞的存在是肝癌化疗失败的根本原因。研究显示，抗肿瘤药物能够引起丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinases，MAPKs)信号传导系统的激活及MDR的产生，而通过调节肿瘤细胞MAPK激酶系统的表达有可能逆转MDR。本课题拟采用阿霉素和5-氟尿嘧啶诱导建立多株稳定的MDR肝癌细胞模型，并对肝癌细胞(MDR+/MDR-细胞)中MAPK表达谱进行研究，旨在深入探讨MAPK家族成员的表达与活性对肝癌细胞MDR的影响，期望能为MAPK作为逆转治疗肝癌细胞MDR的分子靶点提供理论依据。　　 方法：　　 采用药物浓度梯度递增诱导法诱导亲本细胞建立人肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU，MTT法测定其多药耐药性。流式细胞仪分析细胞周期并检测多药耐药相关蛋白P-gp(P-glycoprotein)和MRP1(multidrug resistant protein1)表达。荧光定量PCR检测人肝癌多药耐药细胞和亲本细胞中MAPK关键激酶的mRNA表达，western-blot检测MAPK关键激酶蛋白表达及其磷酸化水平。采用MAPK通路磷酸化抗体芯片筛选人肝癌多药耐药细胞HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU与亲本细胞间差异表达的MAPK信号转导通路蛋白。　　 结果：　　 MTT检测发现，诱导建立的HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU细胞不仅对各自的诱导药物ADM及5-FU存在耐药性，而且对其它多种化疗药物均存在耐药性。与亲本细胞相比较，人肝癌多药耐药细胞P-gp表达量显著增高，而MRP1的表达并无显著变化。细胞周期分析显示，HepG2/ADM细胞G2/M期细胞分布比率明显增高，SMMC7721/ADM细胞S期比率明显增高，而BEL7402/5-FU细胞G0/G1期比率明显增高伴随有S期比率明显降低。实时荧光定量PCR检测发现人肝癌多药耐药细胞和亲本细胞中均可检测到ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3、P38α、P38β、P38γ、P38δ及ERK5 mRNA表达，它们在BEL-7402/5-FU和SMMC7721/ADM中的表达水平全部是显著降低的，但在HepG2/ADM中，除P388 mRNA表达无差异外，其余9种MAPK关键激酶的mRNA表达都是增高的。Western-blot检测显示，MAPK关键激酶的蛋白表达水平变化多样，其蛋白磷酸化水平相对一致；p-ERK1及p-ERK2蛋白在HepG2/ADM和SMMC7721/ADM中的表达水平明显降低，但在BEL-7402/5-FU中的表达水平增高；p-JNK1和p-JNK2/3蛋白表达水平在SMMC7721/ADM中明显降低，但在HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU中没有明显变化；p-ERK5蛋白表达在HepG2/ADM中无明显变化，但在SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU中明显降低。MAPK通路磷酸化抗体芯片检测结果显示，p-P38蛋白表达在HepG2/ADM明显增高(约11.8倍)，而在BEL-7402/5-FU则降低；在HepG2/ADM和BEL-7402/5-FU细胞中均出现同样改变的蛋白被认为是恒定的差异表达蛋白，共有12个蛋白，占MAPK通路磷酸化抗体芯片总蛋白数的6.49％，可能为人肝癌多药耐药细胞与亲本细胞间的差异表达蛋白。其中表达升高的蛋白有1个，表达降低的蛋白有11个，涉及MAPK通路上游激活物、MAPK上游激酶以及下游底物等多个水平。　　 结论：　　 (1)采用药物浓度梯度递增诱导法成功建立人肝癌多药耐药细胞系HepG2/ADM、SMMC7721/ADM和BEL-7402/5-FU；与亲本细胞相比较，人肝癌多药耐药细胞系细胞周期分布发生改变，这种改变不仅与耐药肿瘤细胞的增殖能力降低有关，而且可能是多药耐药产生的机制之一；P-gp参与了人肝癌多药耐药细胞系药物转运泵介导的耐药机制，而MRP1与之无关。　　 (2)MAPK关键激酶在人肝癌多药耐药细胞和亲本细胞中均普遍表达；对于P-gp介导MDR的人肝癌细胞多药耐药细胞，MAPK关键激酶在基因水平、蛋白水平以及蛋白磷酸化水平的表达变化趋势并不一致；多数情况下，ERK1、ERK2、JNK1、JNK2、JNK3和ERK5的活性与MDR间呈负相关，但P38活性表达与MDR是正相关或负相关，尚需深入研究加以明确。　　 (3)蛋白芯片能够成功筛选出人肝癌多药耐药细胞和和亲本细胞间差异表达的MAPK信号转导通路蛋白(12种)，为进一步深入探讨肝癌MDR的发生机制、寻找逆转治疗靶点提供了线索。国内外文献未见报道。　　 (4)结合相关文献，我们认为人肝癌多药耐药发生的可能分子机制如下：化疗药物(公式略)　　 但这些MAPK关键激酶及差异表达的MAPK信号转导通路蛋白能否作为逆转肝癌MDR的靶点，还需我们正在进行中的系列研究去证实。