Penifulvin A是由灰黄青霉菌(Penicillium griseofulvum NRRL 35584)产生的具有独特结构的倍半萜类天然产物,其拥有五个立体手性中心,结构中的四个稠环共用中心的季碳原子,形成一个罕见的二氧-[5.5.5.6]-窗烷结构,且其中的两个γ-内酯环和δ-内酯环共享一个手性缩醛中心。生物活性研究显示,penifulvin A具有高效专一的草地贪夜蛾的幼虫(农作物主要害虫之一,尤其是玉米)杀虫活性,被评价为最具开发价值的创新型生物农药之一。鉴于其新颖独特的化学结构以及良好的生物活性,penifulvin A引起了化学家和生物学家广泛关注,目前化学家已借助逆合成分析和间位-光环加成反应实现了penifulvin A的化学全合成,但在立体选择性构建二氧-[5.5.5.6]-窗烷骨架时仍存在一定难度。相对于化学全合成,penifulvin A的生物合成机制却一直未见报道。因此,penifulvin A生物合成途径的研究,有望指导化学仿生合成,同时其特殊的化学结构也必然蕴藏着独特的酶学合成机制。基于此目标,本课题从P.griseofulvum NRRL 35584中鉴定了penifulvin A生物合成基因簇(peni),通过生物信息学分析、体内基因敲除、化合物喂养、体外生物酶催化以及异源生物合成的方法与手段,系统阐明了penifulvin A的生物合成机制,由此深刻解析了自然界中独特窗烷骨架结构的生物合成过程,为后续通过组合生物合成技术对不同窗烷类型天然产物进行改造,从而获得结构更加新颖、杀虫活性更强的衍生物,奠定了坚实的理论和物质基础。本研究完成工作如下:(1)Penifulvin A的发酵条件及其检测分离方法的确定。外界环境因素是影响微生物代谢谱变化的重要原因,为了确定研究penifulvin A生物合成的物质基础,首先确定了P.griseofulvum NRRL 35584在实验室培养条件下生产penifulvin A的条件。小量发酵实验显示,P.griseofulvum NRRL35584在25℃,大米培养基上发酵七天的条件下,能够稳定生产penifulvin A,并通过后续的分离和结构鉴定进行验证。Penifulvin A生产及其检测分离条件的确定,为后续各突变株培养条件和中间体的检测与分离奠定了良好的工作基础。(2)Penifulvin A生物合成基因簇(peni)的鉴定。通过真菌次级代谢基因簇分析网站(anti-SMASH fungal version)预测发现,P.griseofulvum NRRL 35584的全基因组中含有六个萜类次级代谢产物生物合成相关的基因簇。利用结构导向的萜类环化酶系统进化树分析策略,scaffold 14中的萜类生物合成基因簇(peni)被认为与penifulvin A的产生可能有关。生物信息学分析表明,peni基因簇中共含有六个基因,除了倍半萜环化酶基因(peniA)外,还有细胞色素P450单氧化酶基因(peniB),核黄素依赖的单氧化酶基因(peniC),两个双氧化酶基因(peniD和peniF)以及一个未知功能蛋白基因(peniE)。RT-PCR结果显示,peni基因簇的转录与penifulvin A的产生成对应关系。倍半萜环化酶基因(peniA)的进一步敲除结果显示,基因peniA敲除突变株完全丧失了penifulvinA的生产能力,由此清晰地明确了peni基因簇与penifulvinA生产的相关性。peni基因簇的确定,是阐明penifulvin A生物合成机理的重要前提。(3)Penifulvin A生物合成相关基因的确定。peniB~peniF五个基因的逐个敲除以及peniD~peniF三个基因同时敲除的结果显示,peniB或peniC的单基因缺失,P.griseofulvum NRRL 35584均会丧失penifulvin A的生产能力。但是,peniD~peniF三个基因的单独缺失或同时缺失,均不会影响penifulvin A的产生。该结果表明,peni基因簇中仅peniA~peniC三个基因可能与penifulvin A的生物合成相关。进一步的研究显示,通过在异源宿主A.nidulans A1145中共表达peniA~peniC三个基因,penifulvin A能够高效产生,证明penifulvin A的生物合成确实仅需要peniA、peniB和peniC三个基因参与。通过基因敲除及其异源宿主生产结果揭示了自然界中独特二氧-[5.5.5.6]-窗烷杂环的构建过程仅需三个基因参与。(4)倍半萜环化酶PeniA催化功能的研究。通过大肠杆菌中异源表达peniA基因,获得了可溶性的PeniA重组蛋白。体外酶活实验表明,1)PeniA能够催化法呢基焦磷酸(FPP)环化为化合物209,经GC-MS数据库比对确定,该化合物与角三环倍半萜silphinene的断裂碎片一致;2)PeniA对FPP显示出严格的底物选择性,并不能催化GPP和GGPP生产对应的环化产物。酵母异源表达实验证实,基因peniA的酵母高表达菌株能够高效生产化合物209,进一步的分离与核磁鉴定证实209确实为三环倍半萜silphinene。因此,PeniA为之前并未报道过的silphinene倍半萜环化酶。通过对PeniA体外催化功能的研究以及silphinene结构的确认,我们推导了PeniA催化FPP到silphinene的整个环化机理。化合物209的化学喂养结果表明,其能够恢复ΔpeniA突变株penifulvin A的生产能力,从而证实了silphinene为penifulvin A合成的重要前体,这为后续氧化后修饰酶(PeniB和PeniC)催化功能的研究提供了重要的物质支撑。(5)细胞色素P450氧化酶PeniB催化功能的研究。生物信息学分析显示,PeniB为细胞色素P450单加氧酶。peniA和peniB基因的共表达A.nidulans菌株(AN-peniAB)产生三个产物,分别为silphinene-15-oic acid(203)、γ-lactone-2-hydroxy[5.5.5.5]fenestrane(210)和γ-lactone-2-keto[5.5.5.5]fenestrane(211),该结果说明,PeniB作为多功能P450氧化酶,其能够连续催化silphinene的多步氧化反应。PeniB微粒体复合物的体外酶活实验结果表明了PeniB的氧化过程,1)催化209中C-15位甲基的三步氧化反应得到羧基产物203;2)PeniB氧化化合物203得到化合物210;3)PeniB继续催化化合物210 C-2羟基的脱氢反应得到211。化合物203/210/211分别化学喂养ΔpeniA突变株均能恢复penifulvin A的产生,由此证明了PeniB对化合物209的三步氧化产物均为penifulvin A生物合成的重要中间体,其中化合物203到化合物210的转化过程,是构建第一个γ-内酯环的关键一步。由此,推导了PeniB可能通过催化化合物203 C-15位的羧基自由基加成C1-C2的双键或者C-15的羧基进攻C1-C2位的环氧两种机理得到210。为了验证PeniB的反应机理,首先通过化学衍生的方法,获得了化合物203的C-15羧基甲酯化产物214。PeniB与化合物214的体外酶活结果显示,PeniB的催化活性被完全抑制,由此说明C-15位羧基自由基的生成对化合物210中γ-内酯环的形成至关重要。(6)Baeyer-Villiger氧化酶PeniC催化功能的研究。从化合物211到最终产物penifulvin A,需要C1-C2位的位置专一选择性的Baeyer-Villiger氧化反应。生物信息学分析表明,PeniC确实为核黄素依赖的Baeyer-Villiger氧化酶,其可能负责了化合物211到penifulvin A的转化。peniA、peniB和peniC三个基因共表达A.nidulans(AN-peniABC)确实能够检测到终产物penifulvin A的产生。我们试图在大肠杆菌中得到可溶性PeniC蛋白去验证其催化化合物211到penifulvin A的转化,但经过多种尝试,PeniC或者其与其它标签的融合蛋白在大肠杆菌中均为不可溶表达。化合物211分别喂养ΔpeniB及ΔpeniC突变株的实验表明,211虽然能够恢复ΔpeniB突变株penifulvin A的产生,但是其并不能恢复ΔpeniC突变株penifulvin A的产生。由此间接证明了PeniC是催化化合物211形成penifulvin A的关键酶,通过催化C1-C2位的Baeyer-Villiger氧化反应形成δ-内酯环。(7)Penifulvin A生物合成途径的推导。通过对peniA、peniB和peniC基因功能及其对应蛋白催化功能的研究,推导了penifulvin A生物合成的可能途径,1)PeniA催化线性FPP前体环化得到角三环骨架倍半萜silphinene(209);2)PeniB催化209经多步氧化反应得到211,其间完成了γ-内酯环的构建;3)PeniC催化211发生C1-C2位的Baeyer-Villiger氧化反应形成δ-内酯环,从而得到终产物penifulvin A。Penifulvin A生物合成途径的阐明,为自然界中其它窗烷类天然产物生物合成的研究以及penifulvin类衍生物的合成生物学改造奠定了良好的基础。