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目的:慢性肾脏病(CKD)患者心血管疾病的发病率远高于普通人群。血管内皮是多种危险因子作用的靶器官,其功能障碍是动脉粥样硬化等一系列心血管疾病的触发和促进因素。许多研究证实,除外传统危险因素,尿毒症毒素蓄积在内皮损伤中也起到重要作用。马尿酸是一种蛋白结合类尿毒症毒素。近期研究发现,随着血清马尿酸浓度的升高,CKD患者心血管风险有增加的趋势,提示两者间可能存在一定的关系。本研究旨在评估CKD患者的凝血状态特别是血管内皮功能的变化,分析CKD患者血清马尿酸水平与内皮损伤标志物的关系,并通过体内外实验验证马尿酸对内皮细胞功能紊乱的影响,探讨线粒体动力相关蛋白(Drp1)介导的线粒体分裂是否参与了马尿酸诱导的内皮功能障碍。方法:1.纳入非透析成年CKD患者95名及20名健康志愿者,收集临床资料;检测内皮功能,血小板功能,主要凝血因子及抗凝物质;完善常规凝血检测和血栓弹力图检测,评估CKD患者的凝血状态特别是血管内皮功能的变化。2.纳入符合入选标准的CKD患者151例,收集临床资料,通过ELISA检测血清马尿酸水平,确认CKD患者是否存在马尿酸毒素蓄积;并分析血清马尿酸水平与内皮功能损伤指标sICAM-1,sVCAM-1,vWF的相关性。3.体外培养人主动脉内皮细胞(HAECs),不同浓度马尿酸(0,1,2,4mmol/l)刺激HAECs探究马尿酸诱导内皮细胞损伤的剂量-效应关系。在同等浓度(4mmol/l)马尿酸的刺激下,延长作用时间(0,12,24,48h)探究马尿酸诱导内皮细胞损伤的时间-效应关系。检测HAECs的细胞及线粒体ROS水平,并应用线粒体抗氧化剂Mito-TEMPO预处理后检测马尿酸诱导测内皮损伤指标表达的变化。动物实验建立CKD大鼠模型(5/6肾切除)及马尿酸慢性毒素蓄积大鼠模型(予以50mg/kg马尿酸i.p.,6周),利用高效液相色谱分析法检测两种模型血清马尿酸水平,评估模型的代表性。造模结束后取离体主动脉环进行内皮依赖性的血管张力实验。4.在细胞和动物水平上,通过电子透射显微镜及Mitotracker荧光染色观察马尿酸刺激后的内皮细胞线粒体形态并检测线粒体分裂相关蛋白(Drp1,Fis1,Mff)的表达情况。抑制血管内皮的Drp1(Mdivi-1预处理或Drp1 siRNA转染)后,检测线粒体形态、氧化应激水平、线粒体膜电位及血管内皮功能的变化。结果:1.一般线性模型校正危险因素后,CKD患者内皮损伤指标vWF,部分凝血因子(纤维蛋白原,Ⅶ因子,Ⅷ因子)以及D-二聚体水平明显高于健康者。且随着eGFR的下降,vWF、Ⅷ因子水平逐渐升高。提示CKD患者存在血管内皮功能损伤以及明显的高凝状态。2.与健康者相较,CKD患者的血清马尿酸、炎症因子(IL-2,IL-6)水平明显升高,超氧化物歧化酶(SOD)水平降低。相关性分析显示,CKD患者血清马尿酸水平与内皮损伤指标(sICAM-1、sVCAM-1、vWF),炎症指标(IL-2、IL-6)均呈正相关,而与SOD负相关。3.细胞实验结果显示,无论在蛋白还是mRNA水平,马尿酸均呈浓度及时间依赖性地诱导人主动脉内皮细胞eNOS表达下降及ICAM-1、vWF表达升高,并增加胞浆及线粒体ROS的产生。应用线粒体抗氧化剂Mito-TEMPO能一定程度上逆转由马尿酸引起的血管内皮细胞损伤。动物实验结果显示,两种模型大鼠(CKD模型和马尿酸模型)的血清马尿酸水平显著升高。与Sham组及对照组相比,CKD组与马尿酸组大鼠胸主动脉血管环对氯化乙酰胆碱(Ach)诱导的内皮依赖性舒张反应明显降低。4.在细胞及动物实验中,马尿酸均可致血管内皮Drp1表达明显升高,线粒体分裂增加,呈片断状或点状。抑制Drp1可减轻内皮细胞线粒体分裂,降低ROS水平,改善线粒体膜电位,改善模型大鼠因马尿酸蓄积而致的内皮依赖性血管舒张功能障碍,并上调主动脉内皮eNOS的表达和降低vWF、ICAM-1的水平。结论:CKD患者存在血管内皮功能损伤及明显的高凝状态。CKD患者血清马尿酸水平显著升高,且马尿酸与其内皮功能紊乱指标存在相关性。细胞及动物实验均证实马尿酸可诱导血管内皮氧化损伤。Drp1介导的线粒体分裂增加在马尿酸诱导的内皮功能障碍中具有重要的调控意义。抑制线粒体分裂,特别是抑制Drp1,对CKD及马尿酸诱导的内皮损伤起到保护作用。