背景和目的1993年Hood等首先提出了富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)的概念[l],PRP是通过离心全血后得到的血小板浓缩物,含有高浓度生长因子。不同于原来造价昂贵、使用剂量高、有效期限短且无法有效传递至目标细胞的重组人类生长因子,作为一种自体生物材料,PRP具有制备简单、易于操作、价格低廉、生物安全性高、并发症(如疾病传播和免疫反应)少等优点[4],故被广大研究者和临床医师公认为具有广阔的应用前景。激活的PRP通过大量生长因子如血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)和转化生长因子p (TGF-p)等发挥联合或协同作用,影响成骨细胞的趋化、增殖和分化,促进骨组织的形成和再生,至今PRP已被成功应用于颌骨、颅骨和脊柱的骨移植手术、心血管手术和相关的代谢性骨疾病的治疗。在骨组织工程研究中,寻找能充分发挥组织再生潜力的支架材料和构建生物学微观环境是研究的核心内容。Xie,X等的研究表明：PRP可形成一个网眼样超微结构组成的3D支架,并能释放内源性生长因子,且迅速与细胞结合。间充质干细胞植于PRP支架后表现出较高的增殖速率、软骨相关基因和蛋白的表达。在兔的骨缺损模型中植入含有骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的PRP支架也表现出更好的成软骨方面的大体和组织学、免疫组织化学特性,成软骨相关基因和蛋白的表达增强,且可促进软骨下的骨组织再生。在骨的形成和修复中骨膜通过血管形成和提供骨祖细胞发挥着关键作用。Elbackly RM等提出了使用PRP薄膜和自体骨髓来源BMSCs (PRP/BMSCs凝胶薄膜)作为骨膜替代物围绕着骨引导支架来引导骨缺损的再生,研究发现PRP/BMSCs凝胶薄膜在体外能够显著地诱导人内皮细胞的迁移,并且增加人工培养的BMSCs的骨形态发生蛋白-2(BMP-2)表达；这些细胞还分泌大量的可溶亲血管生成因子如PDGF-BB、VEGF、IL-8等,促进血管的形成。最终,PRP/BMSCs凝胶薄膜作为骨膜替代物在免疫抑制小鼠和兔部分骨缺损动物模型中,均验证了它在骨膜仿生中发挥的增强骨再生作用。刘兴文等[8]通过体外观察PRP对自体BMSCs碱性磷酸酶活性的影响,结果显示PRP能促进BMSCs成骨标志物碱性磷酸酶活性,说明PRP能诱导BMSCs向成骨细胞分化,并且提高BMSCs的分化能力。但是,也有一些反对者认为PRP没有或很少有正面的促进作用。Aghaloo等[9]在一个对兔颅骨缺损修复的动物实验中发现,PRP加入自体骨移植后组织形态评估显示仅轻度大于单独的自体骨移植,并未发现显著性差异。一些研究甚至表明PRP起到了负面的抑制作用,PRP在免疫功能不全的老鼠实验模型中,减少了脱矿骨基质的成骨诱导,并且抑制了脱矿骨基质的活性。BMSCs来源于中胚层,具有很强的自我复制和横向分化潜能,大量的研究表明,在体外特定的诱导条件下BMSCs可分化为骨、软骨、神经、脂肪、肌肉及肝等多种功能细胞,对间质组织如骨、软骨、肌键、脂肪和骨髓基质的再生也有重要作用。Maniatopoulos等首次报道了从成年大鼠的骨髓获取的BMSCs,在体外培养条件下能形成钙化的骨样组织,经X线衍射分折,证实钙化组织具有羟基磷灰石样结构。实验表明体外培养BMSCs可以向成骨细胞分化并形成类骨组织。Ouyang等在培养基内加入抗坏血酸后发现BMSCs排列紧密呈片状生长,将BMSCs片与移植骨片结合植入受损部位,3周后形态与组织学结果表明,植入物的结构与正常骨膜相似,并向成骨分化。国内诸多研究也证实BMSCs的体外成骨转化。由于BMSCs免疫原性较弱、培养技术简便、体外增殖迅速、且可被冷冻保存,因此它己成为细胞及基因治疗研究中的种子细胞,并具有潜在的临床应用价值。现阶段在BMSCs的体外研究中,细胞的体外培养、扩增、分化和冻存等一般都需使用含胎牛血清或小牛血清制品,外源性血清的使用,使得干细胞在骨组织工程及临床应用中存在导致人畜共患疾病传播的风险。而现有的PRP制备一般需加入外源性物质(氯化钙、人或牛凝血酶等)来激活血小板,以促进大量的生物活性蛋白的产生和释放,外源性物质的加入,使PRP应用于临床及骨组织工程研究中也存在传染病传播及免疫排斥的风险。段建民等采用液氮冻融的方式激活血小板,制成改良富血小板血浆(modified platelet-rich plasma,mPRP),实验研究显示mPRP对人牙髓细胞、小鼠成骨细胞等的增殖具有明显促进作用,并且该作用具有浓度依赖性。与传统的血小板激活方式相比,液氮冻融不仅可以完好保存血小板内生长因子和生物活性蛋白的活性,而且可以避免因使用人或动物等外来凝血酶而出现传染性疾病和免疫排斥反应的风险。本实验的目的是观察mPRP对体外培养的人BMSCs增殖及成骨向分化的作用效果,进而为将来使用mPRP替代外源性血清制品,来提高骨组织工程中人BMSCs(种子细胞)体外扩增培养的生物安全性提供实验依据。方法1.mPRP的制备从提供骨髓的志愿者肘静脉采集血小板,二次离心法分离获得PRP,全血细胞分析仪进行血小板计数后,将PRP分装入冻存管内,液氮反复冻融3次激活后离心,吸取上清液过滤用于实验。2.人BMSCs的分离和培养抽取健康志愿者骨髓血5mL,密度梯度离心法分离人BMSCs,连续3代传代纯化培养。3.人BMSCs的鉴定取第三代人BMSCs,以1×105个／孔的密度接种于6孔板中,待细胞进入对数生长期后分别换为成脂诱导液和矿化诱导液,于诱导第14d、21d后分别进行油红O染色和茜素红染色。取人BMSCs悬液行流式细胞术检测细胞表面抗原CD44、CD105、CD34、 STRO-1。4.mPRP对人BMSCs增殖的作用取生长良好的人BMSCs,接种至96孔板,分别加入含2%、5%、10%、20%mPRP的a-MEM培养液,含10%胎牛血清的a-MEM培养液作为对照,隔天每组取4孔,CCK-8法测定,以时间为横轴,OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。5.mPRP对人BMSCs矿化的作用取第三代人BMSCs,于不同浓度mPRP矿化诱导液中培养7d,按碱性磷酸酶(ALP)试剂盒要求测定ALP活性；不同浓度mPRP矿化诱导液培养21d后,茜素红染色观察矿化结节形成情况。6.mPRP对人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA表达的作用实时荧光定量PCR (RT-PCR)测定以不同浓度mPRP矿化培养液培养7d的人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA的相对表达量。7.统计学分析采用SPSS13.0软件行单因素方差分析,结果以均数±标准差(x±s)表示,P<0.05为差异有显著性意义。结果1.PRP血小板计数全血中血小板浓度为187×109L-1, PRP中血小板浓度为1001×109L-1,约为全血浓度的5.4倍。2.人BMSCs的生长和纯化人BMSCs培养48h后可见少量细胞贴壁,细胞呈梭形,培养10d后细胞增生为成纤维样,有少许不规则突触,呈团簇状生长。约2周后细胞达到80%左右融合,连续培养至第3代时细胞形态较均一,呈长梭形,胞核居中。3.人BMSCs的鉴定结果人BMSCs经成脂诱导2周后油红O染色可见胞浆内含有橙红色融合脂滴；经成骨诱导3周后,茜素红染色可见红色矿化结节形成。人BMSCs中CD44、CD105和STOR-1表达为阳性,而CD34表达为阴性,符合人BMSCs表面标记物一般表型。4.mPRP对人BMSCs增殖的作用在不同浓度mPRP培养液培养下,人BMSCs于第4d进入对数生长期,5%-10%的mPRP组与对照组(10%FBS组)相比较,在培养第6d、8d均促进了人BMSCs的增殖,其中以10%mPRP浓度组尤为明显。5.mPRP对人BMSCs矿化的作用5%和10%浓度的mPRP均显著提高了矿化培养7d后人BMSCs的ALP活性；连续矿化培养21d后,5%mPRP组中茜素红染色矿化结节面积比显著大于对照组(10%FBS组)。6.mPRP对人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA表达的作用RT-PCR显示5%浓度mPRP培养的人BMSCs矿化诱导组OCN和RUNX-2mRNA的相对表达量较对照组显著上调。结论本实验成功分离培养的人BMSCs具有干细胞特性,表达干细胞表面标记物,且具有成骨向、成脂向分化能力。与胎牛血清比较,5%-10%的mPRP显著促进了人BMSCs的增殖,其中以10%浓度组尤为显著；5%的mPRP具有促进人BMSCs成骨向分化的作用。结果表明mPRP在体外促进人BMSCs增殖与分化的作用具有浓度特异性,将自体来源mPRP用于以人BMSCs为种子细胞的骨组织工程中具有较高的生物安全性。