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前言 肝移植目前已成为治疗终末期肝病、肝肿瘤、先天性肝胆疾病的重要且有效的治疗方法，但是肝再灌注损伤仍是制约肝移植成功的主要因素之一。再灌注损伤的发病机理至今尚未被完全阐明。褪黑素(Melatonin，Mel)是松果体腺细胞分泌的神经内分泌激素，由于其在多系统、多脏器发挥着复杂的生理、药理作用，因此日益受到人们的重视而成为研究的热点。在国内，有关褪黑素在再灌注损伤方面的研究较少，有关Mel在肝再灌注损伤中的作用鲜见报道。本实验以大鼠为研究对象，建立肝再灌注损伤模型为手段，按时点采集标本，对血清肝组织生化酶系(ALT，AST，AKP)，肝组织匀浆脂质过氧化物的终产物(MDA)及肝组织抗氧化酶系(SOD，GSH．px)进行测定；对肝组织进行HE染色及ICAM-1免疫组化染色，光镜下观察肝组织细胞形态学改变；并在此基础上进行电镜观察肝细胞核及细胞器，探讨褪黑素对大鼠肝再灌注损伤的影响作用及其机制。在亚细胞(蛋白表达)水平上，探讨褪黑素对肝再灌注损伤保护作用的机制，为褪黑素在临床肝脏外科的应用提供依据。 实验材料与方法 一、实验材料 1．实验分组 150只健康雄性Wistar大鼠(体重：190g—210g，周龄：6—7周)，随机分为褪黑素处理组(Mel组)、酒精溶媒对照组(Alc组)和生理盐水对照组问S组人建立肝再灌注损伤模型，缺血时间均为 60分钟，之后每组分别接再灌注后 0．shJ Jh、12h、24h采集标本。 2．动物模型制备 参照Kobarashi法，采取以动脉夹夹闭肝门静脉左支、肝动肝左支、左肝管60分钟之后放开，建立大鼠肝左叶、中叶融注损伤模型。 3．药品及给药方式 褪黑素（MelatoninN，酒精生理盐水溶解后低温保存，按体重20mg／kg体重计算给药量后，于缺血前30分钟腹腔注射；溶媒对照组采取与Mel组相同浓度的酒精液，生理盐水对照组则注射同比例的生理盐水c 4．标本采集及处理 4．l 麻醉给药方式及剂量 麻醉采取用硫喷妥钠缺血手术前45分钟门腹腔给药前is分钟）大鼠股一头肌肌肉注射，按40mg／kg体重给药。 4．2 相关试剂 HE染色及免疫组化标本均采用多聚甲醛磷酸缓冲液。电镜标本则采用Kamovsky液。SOD、GSH．Px、MDA试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。血生化相关试剂购自德国宝灵曼公司。ICAM－l试剂盒购自英国Serotech公司。 4．3 相关仪器 透射电子显微镜／光学显微镜及其照像系郭全自动生化分析仪／石蜡切片w分光光度中恒温水微电磁搅拌财离心抓超声乳化机 4．4 标本的采集 第一步：大鼠血清生化酶系 第二步：大鼠肝组织匀浆丙二醛及抗氧化酶系 ·2· 第三步：大鼠肝脏形态学、免疫组化及电镜取材 二、实验方法 1．血清肝组织生化酶系ALT、AST人KP的测定（自动生化分析仪） 2．肝组织抗氧化酶系SOD、GSH．PX及肝组织过氧化的终产物MDA的测定 2．IMDA的测定一疏代巴比妥酸法 2．ZSOD的测定一黄源吟氧化酶法一NBT还原法 2．3 GSH．PX的测定一DTNB直接显色法 3．再灌注损伤肝组织的病理学检查 4．ICAM一免疫组织化学技术一SP法 5．透射电镜观察肝细胞 6．数据处理及统计分析： 免疫组化结果在400倍光镜下观察，计算每个高倍视野中100个细胞中阳性细胞个数，每张切片计数5个视野，求出均值用XSS表示，得出阳性细胞率。所有数据均用统计专业软件SPSS11．0进行统计，组间比较采用方差分析，各组间相比采用 SNK检验。 实验结果 1．大鼠血清肝组织生化酶系 l．IALT ALT在再灌注后各时点的Md组均显著低于AI。及NS对照组件＜0．05X且lC组与NS组相比无显著性差异。 1．2 AST AST在再灌注后6．oh、12．oh、24．oh时点的Mel组显著低于 Ale及 NS对照组门＜0．05人且各时点内 AIC组与NS组相比无显著性差异。 ·3· 1．3 AKP AKP在再灌注后24．oh时点的Mel组显著低于AIC及NS对照组河＜0．05X且各时点内AIC组与NS组相比无显著性差异。 2．大鼠肝组织抗氧化酶系及脂质过氧化终产物（丙二醛） 2．IMDA MDA在再灌注后6．oh、12．oh、24．oh时点的Mel组显著低于AIC及财对照组p＜0．05广且各时点内AIC组与NS组相比无显著性差异。 2．2 SOD SOD在再灌注后12．oh、24．oh时点的Mel组显著高于以 及 NS对照组（P＜0．05人且各时点内 AIC组与 NS组相比无显著性差异。 2．3 GSH．px GSH．px在再灌注后12．oh、24．oh时点的Mel组显著高于AIC及NS对照组门＜0．05人且各时点内AIC组与NS组相比无显著性差异。 3．大鼠肝组织ICAMJ免疫组化染色 Mel组再灌注后各时点的阳性细胞率均显著低于对照组（它括酒精溶媒对照组一AIC。hcf和生理盐水对照组一N．S．＊P＜0．05人且每时点内的AICOhol组与N．S．组相比无显著性差异。 4