研究背景神经母细胞瘤(Neuroblastoma, NB)是小儿最常见的中枢外恶性实体肿瘤,起源于胎儿期或出生后早期的神经嵴交感神经细胞,总的发生率约为1/10万儿童。肿瘤异质性特征明显,临床上,肿瘤可以在不治疗情况下,消退或分化成熟；相反,对于综合强力治疗无反应的临床表型,亦可能表现为快速进行性恶化。体外培养神经母细胞中可以观察到三种类型：成神经细胞型(neuroblastic, N-type)、基底粘着型(substrate-adherent, S-type)、及介于两者之间的中间型(intermediate, I-type)。其中,中间型细胞因为能在体外自发或是药物引导下定向分化为成神经型或基底粘着型,能够同时表达其余两种形态细胞的分化标志物,在裸鼠和半固体培养基上形成克隆,而被定义为神经母细胞瘤干细胞。工型细胞被认为可能来自恶变的神经嵴干细胞,有可能是神经母细胞瘤潜在的起始细胞。OCT4基因主要表达于胚胎干细胞、生殖干细胞以及未分化胚胎癌中,对于维持胚胎干细胞肿瘤干细胞的多潜能性和自我更新具有极其重要的作用。对于其在神经母细胞瘤或者干细胞中的研究甚少,其与神经母细胞瘤干细胞的相关性尚不十分明确,有待进一步的研究。研究目的本研究选用具有典型Ⅰ型细胞特性的神经母细胞瘤细胞BE(2)-C为研究对象,通过对OCT4基因表达的调控,观察其对神经母细胞瘤干细胞分化和自我更新等于细胞生物学特性的变化的影响。材料与方法1.神经母细胞瘤细胞BE(2)-C培养,于传代时在培养基中分别加入10μMN型细胞诱导分化药物RA (retinoic acid)或S型细胞分化诱导药物BrdUrd(5-bromo-2’-deoxyuridine),培养7天和14天,观察并记录细胞形态变化,收取细胞,提取总RNA和总蛋白质,利用蛋白印迹(western blot)和实时荧光定量RT-PCR进行OCT4基因表达测定。2.利用慢病毒构建RNA干扰载体并转染BE(2)-C细胞促使OCT4基因表达下调,进行CCK-8比色法检测细胞增殖变化,利用软琼脂克隆形成实验检测细胞自我更新能力,观察细胞形态改变并使用蛋白印迹(western blot)及实时荧光定量RT-PCR(real time RT-PCR)检测细胞分化成神经型标志物Peripherin和NF68,以及基底粘着型标记物Vimentin和S100的相对表达变化,了解细胞系分化发展方向。3.利用慢病毒构建OCT4基因过表达载体并转染BE(2)-C细胞,促使OCT4基因表达上调,进行CCK-8fa法检测细胞增殖变化,利用软琼脂克隆形成实验检测细胞自我更新能力,观察细胞形态改变并使用western blot及real time RT-PCR检测成神经型标志物Peripherin和NF68以及基底粘着型标志物Vimentin和S100的相对表达变化,了解细胞分化发展方向。4.应用基因表达谱芯片检测和分析OCT4基因下调时影响BE(2)-C细胞生物学特性过程中相关基因的表达变化。结果1. RA作用下,BE(2)-C呈现明显的成神经细胞型变化,有数目和长度不等的神经突样细胞突起,生长呈饱和状态,细胞漂浮聚集形成假神经节；BrdUrd作用后,细胞体变大,呈扁平状,贴壁紧密,接触抑制生长,呈明显的基底粘着型变化。与正常培养基培养的对照细胞相比,BrdUrd诱导后,OCT4的表达在蛋白质和RNA水平均下调,而RA诱导后,OCT4表达无明显变化。2.和转染空载体对照组相比,OCT4表达下调组细胞生长减慢或趋于停滞,细胞形态呈现基底粘着型改变,细胞体变大贴壁紧密,出现生长接触抑制而单层生长；无法在软琼脂上形成克隆,培养14天后仍以接种时的单细胞状态存在；Peripherin和NF68在RNA和蛋白水平均降低,而Vimentin和S100均升高,提示细胞脱离中间形态,向基底粘着型分化。3. OCT4表达上调后,细胞形态未发生明显变化,仍旧是典型的中间型细胞,少而短的神经突样突起,轻度接触抑制生长；增殖轻度加快；在软琼脂上克隆形成增强,与空载体对照组相比,克隆集落数目增多,体积变大；细胞分化指标无明显改变,Peripherin和NF68及Vimentin和S100在蛋白水平均未见明显变化。4. OCT4基因表达下调时基因表达谱芯片筛得具有显著差异表达的基因有RET、RGS8、FIGF、FRRS1、SPRY4和FAM72D、DLGAP5、NEK2、ALDOC、HMGCS1。结论1. Ⅰ型神经母细胞瘤细胞BE(2)-C具有双向分化功能,在向S型分化时,干细胞标志物OCT4基因表达下调,干细胞特性减弱。2. OCT4的表达对于维持Ⅰ型细胞的干细胞特性是必不可少的,其表达下调,细胞失去自我更新能力,促使细胞向相对良性类型发育分化,提示临床可以作为治疗靶点。3.0CT4的表达与神经母细胞瘤恶性程度成正相关,提示其可作为检测治疗预后的指标。