中暑是严重威胁人类生命健康的疾病,发病率高,致死率高,致残率高。随着全球温度变暖,发病率逐年上升。中暑可以引起全身多器官和系统的损害,对神经系统的损害尤为明显和严重。中暑患者可以出现头痛、抽搐、意识丧失、躁狂、淡漠、认知功能下降等神经系统受累表现。有关中暑的研究中以人和动物为研究对象居多,但是面临两个问题就是:一、制造中暑的动物模型不统一,不同动物模型中动物加热采用的高温和时间各不相同[1-4],这就会对各种实验结果产生一定的影响。绕过动物模型,直接加热原代培养的大鼠皮层神经元,可以很好的解决上述矛盾。二、没有全面掌握不同高温情况对神经元本身受到的伤害表现和规律特点。我们通过设定不同高温和加热时间的组合,全面观察不同情况高温处理下神经元的病理变化,全面模拟高温损伤后神经元元损伤的病理变化规律,为进一步防治中暑奠定基础。我们通过大量实验研究,摸索建立了一种新的通过新生乳鼠皮层培养高纯度、高成活率、高产量神经元的方法。通过在不同温度和暴露时间加热神经元,观察不同高温设置下神经元的死亡率,探索高温加热神经元后神经元死亡的病理变化规律。同时我们还进一步研究了常见中暑情况下神经元坏死和凋亡的具体情况以及相关蛋白Cas-3、HSP70含量的变化,为进一步防治中暑做了初步的研究。第一部分构建改良的大鼠原代皮层神经元的培养模型研究目的:建立稳定的高纯度、低死亡率的大鼠皮层神经元培养方法。研究方法:参考Beaudoin等人[5]和Giordano G等人[6]、王旭辉等人[7]的实验方法,并经过适当摸索改进。采用新生12h内的Wistar大鼠,麻醉后低温下干净分离出双侧大脑皮层,剪碎组织后予胰酶消化,消化后轻柔吹打组织,然后过滤再离心,弃上清并添加适量接种液,轻轻吹匀后再次过滤,光镜下计数细胞密度,用接种液稀释至适当浓度接种。接种后第4h、45h、96h全量更换培养液。结果:神经元培养第5天,光镜下见神经元形态饱满透亮、背景干净,固缩的死亡细胞少。行神经元特异性标志物NSE免疫组化鉴定,NSE阳性率超过95%。行NMDAR1抗体染色,观察发现神经元细胞突起长、交联丰富充分。行台盼兰染色,阳性细胞非常少,神经元死亡率小于5%。结论:建立了一套简便、稳定、高纯度、低死亡率、高产量、低背景的皮层神经元培养方法。第二部分不同高温和暴露时间处理下神经元损伤情况的研究研究目的:探索不同高温和暴露时间处理下神经元的病理改变和死亡情况的变化规律。研究方法:神经元培养第5d,在37℃5%CO2培养箱中分别给予细胞39℃、41℃、43℃、45℃、47℃加热,加热45min或者1h。加热24h后,光镜下观察神经元形态改变;台盼兰染色后观察细胞形态并统计各个模式下细胞的死亡率;Annexin/PI染色后荧光显微镜下观察细胞在各种温度下坏死和凋亡情况。结果:加热45min情况下,神经元对热不敏感,最高可以耐受45℃的高温。加热1h的情况下,随着温度逐渐升高,神经元死亡率逐渐增高。43℃及以下的高温作用1h,神经元死亡以凋亡为主。45度及以上高温作用1h,神经元死亡以坏死为主。结论:不同高温和暴露时间是影响神经元死亡率的重要因素。神经元可以最高耐受45℃度的高温45min。43度以下的热打击主要造成神经元部分凋亡,43度以上的高温,神经元开始大面积坏死。第三部分模拟临床常见高温中暑情况下神经元损伤的进一步研究研究目的:探索临床常见致中暑温度下神经元坏死凋亡的具体情况以及相关蛋白的变化规律。研究方法:神经元培养第5d,在37℃5%CO2培养箱中分别给予细胞41℃、43℃加热1h。加热24h后,光镜观察神经元形态学变化;Annexin/PI荧光双标染色后流式细胞仪计数神经元坏死、凋亡比例并统计学分析;免疫细胞化学染色Cas-3、HSP70,Image-Pro Plus 6.0软件进行IOD值的扫描后统计分析。结果:神经元41℃、43℃加热1h后,神经元小部分死亡,以细胞凋亡为主,温度越高凋亡细胞越多。存活细胞形态无明显变化。Caspase-3表达强度:37度对照组<41度1h组<43度1h组。HSP70表达强度:43度1h组<37度对照组<41度1h组。结论:临床常见致中暑高温热打击情况下,神经元仅小部分死亡,主要以凋亡为主。41度1h较43度1h加热情况下凋亡细胞少,Cas-3表达低,HSP70表达高,这可能与HSP70高表达的抗凋亡保护作用有关。