冰结构蛋白是一类生物体为抵御外界寒冷环境的应急反应过程中而产生的多肽,具有热滞活性、阻止冰晶形成、修饰冰晶形态及抑制重结晶的能力。本文以“肇东”紫花苜蓿干草为原料,研究了冰提结合法磷酸盐缓冲溶液法提取苜蓿冰结构蛋白、分离纯化、检测其抗冻活性,并对对安琪酵母菌进行抗冻保护作用的研究。采用改进的冰提结合磷酸盐缓冲溶液法提取苜蓿冰结构蛋白,经单因素实验及响应曲面实验得到提取苜蓿冰结构蛋白的最佳工艺参数为:料液比为1:20,缓冲液pH 8.0,磷酸盐缓冲液浓度为61 mmol/L,每百毫升粗提液添加冰球量为46个,其最终提取率可达到2.87%。经差热分析仪检测其热滞值为0.54℃。冰晶观察显示,冰晶体积小、数量多、形态丰富,具有很好的冰晶修饰和冰晶生长抑制作用。氨基酸分析结果显示,苜蓿冰结构蛋白含有17种氨基酸,亲水性氨基酸与疏水性氨基酸的比例为7:4。采用SDS-PAGE结合DEAE-52阴离子交换柱层析图谱进行纯化分离,通过对缓冲液浓度、缓冲液pH、上样量等因素进行优化,确定最佳缓冲液浓度为20mmol/L、pH7.5、上样量浓度为40mg/mL。分离得到两个苜蓿冰结构蛋白组分,其相对分子量分别为34KD和52KD。其热滞值均为0.41℃,且都有很好的冰晶修饰和冰晶生长抑制作用。经SHIFF染色鉴定,34KD组分为糖蛋白,52KD组分为非糖蛋白。采用红外光谱对二级结构进行测定,初步推测34KD 蛋白的含量比为 α-helix:β-sheet:β-turn:random coil=13.19:60.21:12.21:19.16。52KD 蛋白的含量比为:α-helix:β-sheet:β-turn:random coil=16.87:39.41:26.69:17.03。将苜蓿冰结构蛋白应用于安琪酵母菌的冷冻保藏中,考察了苜蓿冰结构蛋白的添加量、冷冻温度、冷冻时间、多次冻融对安琪酵母的冻藏影响。结果显示:添加组的存活率高于对照组,苜蓿冰结构蛋白的添加对改善安琪酵母在冻藏中的存活率具有一定的影响,且适合多次冻融和较低温度的冻藏,说明苜蓿冰结构蛋白对安琪酵母具有很好的抗冻保护作用。