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内皮抑素(endostatin)是一个20kDa的蛋白质,能够抑制新生血管的生成。血管生成是从已有的毛细血管发展而形成新的血管,涉及各种生理和病理过程,如肿瘤的发展、糖尿病视网膜病变(DR)等。血管生成抑制剂的出现,为一些与血管生成相关的疾病的治疗提供了新的手段。本实验室在前期实验中将可以穿过血眼屏障的穿膜肽Tat-PTD与靶向肽RGD分别连接在内皮抑素的两端,设计并表达出了Tat-PTD-Endostatin-RGD,并验证其活性,证明Tat-PTD-Endostatin-RGD具有好的抗细胞增殖活性、抗细胞迁移能力以及穿过血眼屏障的能力,并可以与眼底血管细胞表面受体特异性结合,使内皮抑素可以通过滴眼给药达到眼底,抑制视网膜血管生成。但是,前期实验所制备的Tat-PTD-Endostatin-RGD是以包涵体的形式表达,产率不高;另外Tat-PTD-Endostatin-RGD不稳定,在放置过程中易于沉淀,不利于将来的开发应用。基于这些问题,本论文研究Tat-PTD-Endostatin-RGD 的规模化制备及冻干制剂,为 Tat-PTD-Endostatin-RGD的新药开发奠定基础。本论文的研究内容与结果有以下几个方面:1Tat-PTD-Endostatin-RGD的可溶性表达与纯化研究基于 f.coli BL21、E.coli Rosetta 和 E.coli·Origami2(DE3)3 种大肠杆菌不同的特点,将携带目的基因的质粒分别导入其中,并分别用乳糖及IPTG进行诱导,观察可溶性蛋白的表达量从而筛选出合适的目的蛋白表达系统及诱导剂,然后经过Ni2+-Sepharose的初次纯化并筛选出合适的冲洗缓冲液咪唑浓度,再经过Sephdex-G50的二次纯化,制备出的目的蛋白Tat-PTD-Endostatin-RGD。结果表明,使用E.coliOrigami2(DE3)作为目的蛋白表达载体,乳糖作为诱导剂,冲洗缓冲液咪唑浓度为45 mmol/L时可纯化出目的蛋白约1.3 mg/L菌液。2 Tat-PTD-Endostatin-RGD可溶性表达蛋白的规模化制备研究使用30L发酵罐规模化发酵工程菌,考察筛选了诱导剂的投放量、诱导时间,优化了蛋白分离纯化的条件,并用过CCK-8抗增殖实验进行活性检测。结果表明,使用发酵罐培养大肠杆菌并表达目的蛋白时,诱导剂乳糖的添加为360g/罐,诱导时间应为22-25h。上述条件分离纯化后的目的蛋白15L发酵液产76 mg/罐,CCK-8实验证实Tat-PTD-Endostatin-RGD具有良好的抗内皮细胞增殖活性。3 Tat-PTD-Endostatin-RGD冻干保护剂的筛选对发酵罐产出的目的蛋白进行冻干并进行冻干保护剂的单因素及多因素正交实验,分别使用人血清白蛋白(HSA)、海藻糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、果糖、山梨醇、精氨酸、甘氨酸、盐酸组氨酸与目的蛋白共同冻干,再从中选择保护剂进行三因素三水平正交实验,从而筛选出合适的冻干保护剂组合。单因素实验结果发现,3%HSA对目的蛋白的保护效果最好,选择海藻糖、甘露醇、精氨酸进行三因素三水平正交实验,发现5%海藻糖、1%甘露醇、1%精氨酸、3%HSA(w/v)对目的蛋白保护效果最好。4 Tat-PTD-Endostatin-RGD的稳定性及急性毒性实验对目的蛋白冻干样品的稳定性及急性毒性进行初步考察,分别在-20℃、4℃、25℃的环境中放置,每周取出各环境中保存的样品,测定其水分含量、观察外观、测定复溶时间、复溶过滤后蛋白浓度变化,并用SDS-PAGE检测其分解聚合情况。使用滴眼剂量64倍的目的蛋白对小鼠进行尾静脉注射,并观察有无急性毒性。结果表明,目的蛋白在冷冻干燥以后可以实现较长时间的保存,但会缓慢失活,速度为25℃>4℃>-20℃。小鼠尾静脉注射后未见急性毒性反应。本研究取得的成果和结论:(1)筛选出合适的Tat-PTD-Endostatin-RGD的可溶性表达条件,制备出较纯的可溶性表达蛋白。(2)使用发酵罐规模化发酵并表达可溶性Tat-PTD-Endostatin-RGD,优化了发酵条件。(3)筛选出了合适的Tat-PTD-Endostatin-RGD冻干保护剂,使目的蛋白能够较长时间保存。(4)初步考察了Tat-PTD-Endostatin-RGD的稳定性与急性毒性,发现目的蛋白冻干样品在保存中会缓慢失活,对小鼠未见急性毒性反应。